乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展

乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。     

水牛Sox2基因原核表达载体的构建与诱导表达

水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要,它是重要的多能性干细胞(iPS细胞)标记基因之一,试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2,将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a(+),成功构建了原核表达载体pET-Sox2,然后利用IPTG诱导,获得诱导表达蛋白,并经过SDS-PAGE电泳分析和Wes...     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

"食品级"乳酸菌表达载体系统的研究进展

目前,多数外源基因的克隆与表达,主要采用大肠杆菌.然而,由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻,导致机体损伤,所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准.     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达载体的构建及其诱导表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因(vhb)克隆到融合表达裁体pET28a，在大肠杆菌BL21(DE3)表达。重组蛋白分别在30℃和37℃诱导表达，30℃诱导获得可溶性表达。结果表明：在30℃，1．5mmol／L和2．5mmol／LIPTG诱导下，诱导4—8h透明颠菌血红蛋白可获得高表达——透明颠菌血红蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的18．7％和27．7％。     

猪轮状病毒Vp4全基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。     

无芒隐子草CsLEA基因超表达载体和反义表达载体构建

根据已克隆出的无芒隐子草(Cleistogenes songorica)晚期胚胎发生丰富蛋白基因CsLEA(GenBank序列号为FJ972827)基因和植物表达载体的酶切位点特征, 分别将CsLEA基因编码区序列480 bp正向和反向插入pBI121, 构建了超表达载体pBI121 35S::CsLEA和反义表达载体pBI121 35S::AS-CsLEA。电击法转入根癌农杆菌GV3101中, 并通过花粉管通道法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana), 经卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定, 已获得T1代阳性植株。     

貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。     

杏鲍菇漆酶基因原核表达载体的构建及乳酸菌的遗传转化

为获得有效表达的产漆酶乳杆菌工程菌和既可以产乳酸又可以产漆酶的益生菌制剂。以杏鲍菇为试验材料,利用RT-PCR方法,克隆漆酶基因,将其与乳酸菌食品级表达载体质粒p MG36e进行连接,构建漆酶乳酸杆菌表达载体质粒p MG36e-Lacc1,通过电激转化法使其进入从青贮饲料中提取的布氏乳杆菌中,并探究影响布氏乳杆菌电转化的最适条件。试验结果表明:扩增得到长度为1 596 bp的漆酶基因片段,成功构建漆酶乳酸杆菌表达重组质粒,利用电激转化技术使其导入布氏乳杆菌基因组中,研究表明当电场强度达到1.75 k V,用SMRS培养基复苏培养1.5 h后,得到较高的电激转化率。     

ANXA2真核表达载体的构建

以膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)真核表达载体的构建过程为基础,介绍一种易于成功构建真核表达载体的方法。以Hela细胞来源的cDNA为模板,半套式PCR为基础,通过两次PCR的方法,可获得5’端添加Kozak序列并融合表达HA标签基因和ANXA2的基因片段Kozak-HA-ANXA2,回收后克隆到pMD-18T克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法将其克隆入慢病毒真核表达载体pTRIP中。结果显示,经双酶切和测序之后确定真核重组载体pTRIP-HA-humANXA2构建成功。通过半套式PCR方法构建真核表达载体成功率高,为下一步细胞表达试验创造条件。     

TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX—S—N的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础.     

猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

用RT—PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪γ-干扰素(IFN-γ)基因，经克隆测序表明与已发表序列同源性为100％。将目的基因插入表达载体pcDNA3．1( )，构建出真核重组表达载体IFN-γ-pcDNA。将重组质粒转染COS7细胞，检测转染细胞培养上清IFN-γ活性，结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

犬新孢子虫SRS9基因真核重组质粒的构建及在Vero细胞中表达

为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。     

抑制素与羊GM-CSF基因融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI的构建

为构建抑制素基因与羊GM-CSF基因融合的真核表达质粒,通过EcoRI、XhoI酶切抑制素真核表达质粒pCISI、pEGISI及羊GM-CSF表达质粒pGM-CSF/SS,然后将GM-CSF基因分别插入pCISI、pEGISI,转化DH5α,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,进行酶切和测序鉴定。结果表明,构建的抑制素融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI正确,为研究GM-CSF基因对抑制素基因疫苗的免疫增强作用奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因真核表达载体的构建及其瞬时表达

为了解柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) Serpin基因的生物学特性,本研究采用PCR技术扩增去除信号肽后的Serpin基因,得到1 204 bp的特异性片段,并构建重组表达质粒pVAX1-Serpin,将其瞬时转染HeLa细胞.间接免疫荧光检测表明Serpin基因在HeLa细胞中得到了表达,western blot显示表达蛋白分子量约为47 ku,具有较好的反应原性.该研究结果为E.tenella Serpin核酸疫苗的研究奠定了基础.     

兔防御素cDNA表达质粒的构建及其表达

将兔防御素（MCP－1）cDNA插入真核表达载体pcDNA3的EcorRⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建了兔MCP－1cDNA的真核表达质粒pcDEF。通过脂质体转染，使兔MCP－1 cDNA在COS－7细胞中表达，在转染60、84、108h后，提取总RNA。采用RT－PCR，在288bp的位置扩增出1条特异性带；RNA斑点印迹杂交表明，兔MCP－1 cDNA在60、84、108h均有表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。     

旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。