牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒(BRV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的双重RT-PCR方法.应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp.说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究.     

BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)3种病毒基因序列,设计引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术,用这3对引物对同一样品中的BVDV、BCV、BRV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果可同时扩增BVDV的466 bp,BCV的685 bp,BRV的247 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BRV和10 pg的BCV模板。用45份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,显示两者的总符合率为100%。表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断.     

牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用

为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛肠道病毒（BEV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCV）的方法,根据BVDV 5’UTR基因、BEV 5’UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。     

牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒TaqMan二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区和牛轮状病毒（BRV）VP6基因序列,设计特异性引物和探针。通过对引物和探针浓度、Mg2＋浓度、dNTP浓度和Taq酶用量以及反应条件等因素的优化筛选,建立了能同时鉴别BVDV和BRV的二重荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,与其他病原如CSFV、MB和IBRV不发生交叉反应;敏感性高,能够检测100个BVDV RNA和100个BRV RNA;稳定性好,批内重复和批间重复变异系数小;干扰性试验表明该方法能同时检测2个模板的不同浓度组合。本研究建立的二重荧光RT-PCR方法可用于BVDV和BRV检测,具有特异、敏感、快速、稳定等优点,是BVDV和BRV基础研究、流行病学调查和临床检测的良好工具。     

牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根椐GenBank中已发表中病毒性腹泻病毒(BVDV)、中冠状病毒(BCoV)和中肠道病毒(BEV)基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,继续优化条件,建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用建立的检测方法对临床样本进行检测,计算符合率。结果表明,引物浓度分别为BVDV 0.5μL(20μmol/L),BCoV 0.25μL(20μmol/L),BEV 0.25μL(20μmol/L),退火温度为52℃时,可同时扩增BVDV的289bp,BCoV的458bp和BEV的732bp的特异性片段,对牛流行热病毒(BEFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无扩增。该方法最低能检出6.4pg的BVDV,1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板。对24份临床腹泻病料进行检测,与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法,具有准确、快速、特异的特点,可用于临床混合感染的同时检测。     

牛病毒性黏膜/腹泻病毒与牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为了建立同时检测牛病毒性黏膜/腹泻病毒(BVDV)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR方法,试验采用文献记载的检测BVDV和IBRV的单项PCR方法,设计并合成引物,通过优化反应条件和反应体系,以及特异性和灵敏度试验,建立同时检测BVDV和IBRV的双重PCR方法。结果表明:建立的方法具有高度特异性,可同时扩增出BVDV的244 bp和IBRV的362 bp片段,而对猪瘟病毒(CSFV)与牛轮状病毒(BRV)均无扩增;并且该双重PCR方法对BVDV和IBRV的检测下限均为10 pg;用25份临床样本对双重PCR方法与单项PCR方法进行对比验证,二者的符合率为100%。说明建立的双重PCR检测方法具有特异、灵敏、快速的特点,可用于BVDV和IBRV的同时检测。     

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法.该方法仅对BVDV 5'-...     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10^-1 TCID₅₀/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的RT-PCR方法,并且可以实现在同一体系中对BVDV进行分型。根据GenBank中公布的BVDV基因组序列,针对高度保守的5′UTR区域分别设计鉴定及分型引物,建立牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法。应用鉴定RT-PCR检测方法可从BVDV阳性毒株中扩增出288bp的特异性片段;而分型RT-PCR检测方法可在同一体系中从BVDV1型和2型毒株中扩增出大小分别为316bp和110bp的特异性片段,但对猪瘟病毒、牛副流感3型病毒及牛传染性鼻气管炎病毒等均为阴性,最低可检测出的病毒量分别为1TCID50/mL和10TCID50/mL。临床试验证明,建立的鉴定及分型RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,具有很高的实用价值,为进一步开展流行病学调查、病毒分离等提供可靠的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型三重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)3种病毒基因序列,设计合成引物,建立3种病毒的三重RT-PCR方法。用这3对引物对同一样品中的BVDV、BRSV和BPIV-3核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果显示:可同时扩增BVDV的466 bp,BRSV的735 bp和BPIV-3的258 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV-3和10 pg的BRSV模板。用37份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示:两者的总符合率为100%。结果表明:建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×10⁴、0.92×10⁴和1.53×10⁴拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。     

BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立

参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。     

牛病毒性腹泻的鉴定以及治疗

为了鉴定甘肃武威地区某牛场中牛病毒性腹泻病的发病情况,分别采集了13只病牛的血液样品、粪便样品配合诊断,通过血清学诊断方法和PCR鉴定的方法对样本进行了检测,结果显示血清学方法中的13份血液样本有8份为阳性,粪便样本提取RNA,进行RT-PCR同样可以检测到8份样本中扩增得到片段大小为267bp的条带,检测的13份样本有8份样本的血清学检测和粪便PCR检测均为阳性,本次检测的阳性率为61.54%,结果表明本次检测的甘肃武威地区某养殖场的牛病毒性腹泻阳性率相对较高,需要加强牛病毒性腹泻的防控,采取科学的手段治理该类疾病降低其对养牛产业的损失。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

牛副结核病PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因序列设计特异性引物,对牛副结核分枝杆菌进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为246 bp,与预期扩增序列同源性为99.6%。该PCR检测体系的特异性强,不能在非副结核分枝杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为1 pg。该检测体系的成功构建为牛副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛HSL基因的克隆和生物信息学分析

旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析。根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析。结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9%。HSL蛋白含有一个HSL-Nsuperfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性。半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达。该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考。     

牛布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物,对牛布氏杆菌样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为602 bp,与预期扩增序列同源性为99.7％;该PCR检测体系的特异性强,不能在非布氏杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.9 pg/μL。该检测体系的成功构建为牛布氏杆菌病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。