亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

木奈果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5’非编码区,267 bp 3’非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。     

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物，以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因，全长959 bp，编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因，利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体，为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

草莓psy、pds和zds基因克隆及植物表达载体的构建

设计特异引物,分别克隆草莓类胡萝卜素合成关键基因psy、pds和zds开放阅读框,将psy和pds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建了植物表达载体pBI121psy和pBI121pds.将psy和zds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建植物表达载体pCAMBIA1301psy和pCAMBIA1301zds.将带有完整启动子和终止子的pds基因引入pCAMBIA1301psy中,最终获得psy和pds的双价植物表达载体pCAMBIA1301psy-pds.经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI121psy、pBI121pds、pCAMBIA1301psy、pCAMBIA1301zds和pCAMBIA1301psy-pds 5个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中.该研究结果为进一步研究草莓psy、pds和zds基因的功能奠定基础.     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

烟草红素氧还蛋白基因NtRD1的克隆及其RNAi载体构建

采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术进行烟草红素氧还蛋白基因NtRD1(Nicotianatabacum rubredoxin1)全长cDNA的克降,获得了全长808 bp的cDNA,该cDNA具有完整的开放阅读框架,编码204个氨基酸,其中包含一个保守的红素氧还蛋白结构域.同源分析结果表明,NtRD1与其它植物已克隆的RDs具有较高的一致性.系统发育分析结果表明,NtRD1与其它物种RDs的亲缘关系由近及远依次是马铃薯、水稻、葡萄、拟南芥和藻类.根据RNAi(RNA interference)载体构建原则,成功地构建了干扰NtRD1的RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-NtRD1-RNAi,为进一步探明该基因在烟草中的功能奠定了基础.     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD.     

胡椒 PnNPR2 基因的克隆

基于胡椒转录组数据库,筛选胡椒病程相关基因非表达子基因的 EST 序列,设计引物,运用 RACE 法克隆得 到 1 个 NPR 基因,命名为 PnNPR2;该基因全长 2 260 bp,开放阅读框 1 722 bp,编码 573 个氨基酸;开放读码框含有 BTB/POT 结构域、ANK 锚蛋白重复序列、DUF 和 NPR1-like C 4 个结构域,具有植物 NPR1 所共有的保守结构域,并 将 PnNPR2 基因插入 pCAMBIA1300-35S-sGFP 超表达载体中。本研究结果为 PnNPR2 的功能研究奠定基础。     

木质素合成酶基因反义COMT对亚麻的转化及检测

COMT基因主要参与S木质素的生物合成,转基因植物在COMT活性被抑制时,木质素含量减少,利用杨树皮储藏蛋白(BSP)启动子和该基因构建成反义植物表达载体p BSP-antiCOMT-2301,利用农杆菌介导法将其转入亚麻,经过卡那霉素筛选获得了抗性的愈伤组织,诱导分化后获得了亚麻苗。经特异引物的PCR扩增,证明目的基因已经整合到亚麻基因组中,本研究获得的阳性转基因亚麻植株为亚麻纤维研究及品种选育奠定了坚实基础。     

玉米淀粉分支酶基因的克隆和反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明:克隆片段全长为1 698 bp.将该基因反向插入到pCAMBIA1301的CaMV35S启动子之后,构建了反义表达载体.     

大豆GmGolS基因高温胁迫应答及启动子活性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶。为探究大豆GmGolS基因的高温胁迫调控机制,通过实时荧光定量PCR检测GmGolS在高温胁迫下的表达量,通过PCR从大豆基因组DNA中扩增GmGolS基因启动子序列,将其连接到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GmGolS启动子的高温诱导启动活性。结果表明：高温胁迫可以强烈诱导GmGolS的表达。1 739 bp的GmGolS启动子序列中含1个生长素响应元件、1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点、2个厌氧诱导元件、1个防御和胁迫响应元件、1个脱落酸响应元件、1个茉莉酸响应元件和1个缺氧诱导元件。成功获得3棵GmGolSP转基因烟草植株。GmGolS启动子的活性可以被高温胁迫诱导。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.本研究利用PCR方法扩增出了PEPC基因片段,并将其克隆到pMD18-T Simple载体,序列分析表明克隆片段的长度为728bp.将该PEPC基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体,构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获T1代种子.     

甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶.应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗PSCS基因cDNA全长序列2714bp,其中5'端非编码区为226bp,3'端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2 148 bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7 ku,等电点为6.47.序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucine domain)相对不保守,其它功能区均较为保守.对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合.对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低.     

甜菜抗逆基因P5CS的克隆及盐胁迫下的表达分析

脯氨酸在植物适应逆境胁迫中起重要作用,脯氨酸合成酶(Proline synthetase)是脯氨酸合成代谢的关键酶,深入研究编码该酶的基因,对了解逆境下脯氨酸积累的分子机理、提高其抗逆性意义重大。本研究采用RT-PCR技术从甜菜中克隆了△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,利用生物信息学方法对序列进行了比对及其理化特性、结构域分析,该基因ORF为2 151 bp,编码由716个氨基酸组成的蛋白。序列已提交到GENBANK(ID:KY019201)。采用实时荧光定量PCR技术测定不同时间高盐(300 mmol/L NaCl)胁迫下对甜菜幼苗叶片P5CS基因相对表达量的影响,结果表明:随着处理时间的延长,幼苗受胁迫程度加深,P5CS基因的表达上调明显,进一步说明该基因响应逆境胁迫,本研究为今后深入研究提供了依据。