Mx基因抗性位点在12个地方鸡种中的分布及遗传结构分析

通过PCR-RFLP技术检测Mx基因S631N位点的抗性等位基因A和敏感性等位基因G在我国地方鸡种中的分布差异。结果表明：PCR-RFLP能准确检测出抗性等位基因A与敏感性等位基因G在12个地方鸡种内的突变,抗性等位基因A在所有群体内的基因频率平均为0.304,敏感性等位基因G的频率平均为0.696;12个地方鸡种群体Mx基因S631N位点的观察杂合度平均为0.657 2,Shannon信息指数平均为0.524 0。在该位点上,12个地方鸡种除仙居鸡显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P〈0.01）外,其余11个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P〉0.05）;经Ewens-Watterson中立性检验,该位点在各群体内（除白耳鸡群体外）都属于中立性选择。基于该位点等位基因频率构建的UPGMA聚类图将12个地方鸡种分为3大类,聚类结果反映了12个地方鸡种在Mx基因抗性方面存在的差异和优势。     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

Myf6基因在不同地方鸡种早期生长发育中的表达分析

为了探究Myf6基因在京海黄鸡和金茅黄鸡体内的差异表达规律,研究其在两个品种鸡中可能发挥的作用机制,试验采用实时荧光定量PCR技术对Myf6基因在不同品种鸡不同组织中的表达情况进行了检测。结果表明：京海黄鸡和金茅黄鸡公母鸡胸肌和腿肌中的Myf6基因相对表达量均比较高,且极显著高于脾脏(P<0.01);京海黄鸡心脏组织中的Myf6基因相对表达量显著高于脾脏(P<0.05),金茅黄鸡心脏组织中的相对表达量极显著高于脾脏(P<0.01);两个品种鸡的其余组织中Myf6基因相对表达量与脾脏相比差异不显著(P>0.05)。京海黄鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的表达规律基本一致,仅在4周龄胸肌组织中有稍微下降的趋势,但总体上呈现上升的趋势;腿肌组织中的相对表达量比较稳定,从0周龄到16周龄呈现上升趋势,16周龄时达到最高水平。金茅花鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的相对表达量从0周龄到4周龄呈上升趋势,8周龄有稍微下降的趋势,之后又呈现上升的趋势。在两个品种中,无论是公鸡还是母鸡,胸肌中Myf6基因的相对表达量始终显著高于腿肌(P<0.05)。说明Myf6基...     

鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备

Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性.本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中.以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应.以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性.抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础.     

肌纤维发育相关基因在不同地方鸡种早期生长发育中的表达分析

为研究肌纤维发育相关基因在不同地方鸡种的表达调控作用,选用1日龄体重相近的汶上芦花鸡、济宁百日鸡和鲁西斗鸡,分别在1日龄、1～5周龄采集同一部位的胸肌、腿肌,应用实时荧光定量PCR测定Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN等基因的表达量。结果显示:汶上芦花鸡胸肌中MSTN基因1周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),鲁西斗鸡腿肌中MSTN基因4周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),济宁百日鸡胸肌中MSTN基因4周龄和5周龄表达量显著高于其他周龄(P0.05),腿肌中4周龄显著高于其他周龄(P0.05);汶上芦花鸡腿肌Myf6基因2周龄的表达水平明显高于其他周龄(P0.05),济宁百日鸡胸肌中Myf6基因5周龄时表达量显著低于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P0.05);4～5周龄时,济宁百日鸡腿肌MyoD1基因的表达水平最低,在3周龄时,汶上芦花鸡胸肌MyoD1基因表达水平显著高于其他周龄(P0.05);在0和1周龄时,鲁西斗鸡中胸、腿肌Myf5基因表达水平均高于汶上芦花鸡和济宁百日鸡。研究表明Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN基因在3个地方鸡种胸肌、腿肌中均呈现出不同的表达调控模式。     

Mx基因抗性位点在11个不同鸡种中的分布及遗传结构分析

通过错配PCR技术检测Mx基因S631N位点的抗性等位基因A和敏感性等位基因G在11个不同鸡种中的分布差异。结果显示,错配PCR-RFLP能准确检测出抗性等位基因A与敏感性等位基因G在不同鸡种内的突变,抗性等位基因A在所有群体内的基因频率平均为0.502,敏感性等位基因G的频率平均为0.498;11个不同鸡种群体Mx基因S631N位点的观察杂合度平均为0.506 7,Shannon信息指数平均为0.562 9。在该位点上,11个鸡种,漳州斗鸡、吐鲁番斗鸡、皖南鸡、文昌鸡、如皋鸡、安卡鸡偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)外,其余5个群体均处Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);经Ewens-Watterson中立性检验,该位点在各群体内(除如皋鸡群体外)均属于中立性选择。基于该位点等位基因频率构建的UPGMA聚类图将11个不同鸡种分为3大类,聚类结果反映了11个不同鸡种在Mx基因抗性方面存在的差异和优势。     

黄曲霉素B1可改变鸡肝脏基因的表达

密苏里州立大学的科学家们对可食用性黄曲霉素B1（AFB1）在公鸡肝脏基因中的表达调控进行了研究。他们给试验鸡只分别饲喂AFB1含量为0、1和2mg／kg的饲料,持续饲喂21d。结果显示,黄曲霉素B1可降低试验鸡只的采食量、体重、血浆蛋白、血钙和血磷浓度,但以剂量依赖的方式提高肝重。微点阵分析的结果显示,当饲喂2mg／kgAFB1时,可导致试验鸡只与产能、脂肪酸代谢、生长发育、抗氧化、解毒、抗凝以及免疫保护相关基因下调,而与细胞增殖的基因出现上调趋势。研究人员认为,AFB1的浓度为2mg／kg时,可导致鸡的肝脏出现生理反应,同时将改变肝脏基因的表达。     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly（I）／（C）诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT—PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列。序列分析表明：该基因编码区长2118bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性。通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL—N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近。北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49．5％～76．8％,氨基酸同源性为44．1％～61．6％。据此可以推断：克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关。     

藏鸡和白来航鸡胚胎肝脏EGLN1基因的差异表达分析

本研究旨在研究低氧孵化条件下,藏鸡和低地鸡胚胎肝脏egl-9家族低氧诱导因子1(egl-9family hypoxia-inducible factor 1,EGLN1)基因的表达差异及其与藏鸡胚胎低氧适应的关系。以15%氧浓度下孵化至16 d的藏鸡和白来航鸡胚为研究对象,利用Real-time PCR和western-blot方法对鸡EGLN1基因肝脏组织表达特点进行研究。结果表明:随着氧浓度的降低,白来航鸡胚肝脏中EGLN1基因m RNA表达量极显著下降(P0.01);在低氧条件下,白来航鸡胚中EGLN1基因的表达量显著地低于藏鸡胚胎(P0.05);白来航鸡中EGLN1基因蛋白表达量随着氧浓度下降而下降,趋势与m RNA表达量一致。而藏鸡EGLN1基因的转录和翻译水平均为受到氧气浓度降低的影响。由此可知,鸡胚通过下调EGLN1基因表达从而应对低氧反应。上述结果为进一步研究EGLN1基因与低氧适应的关系提供了依据。     

云南地方猪FATP1基因多态性分析

研究采用测序技术对云南地方猪杂交后代脂肪酸转运蛋白1(FATP1)基因进行了多态性遗传分析。结果显示：在云南地方猪杂交后代FATP1基因第一外显子上存在1个SNP(c.70 C>T)位点,该位点在杜藏猪（杜洛克×迪庆藏猪）群体中无多态性（仅CC型）,在杜小猪（杜洛克×滇南小耳猪）群体和杜小藏猪（杜洛克×滇南小耳猪×迪庆藏猪）群体中存在多态性（CC型和CT型）,均处于Hardy-Weinderg平衡（P>0.05）,且属低度多态（He<0.25,PIC<0.25）。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

鸡VLDLR基因在不同组织中的表达分析

极低密度脂蛋白受体(VLDLR)是低密度脂蛋白受体家族的一员,能以高亲和力结合富含Apo E的脂蛋白,是机体细胞摄取血液中富含甘油三酯的极低密度脂蛋白(VLDL)的主要受体。本研究旨在探讨VLDLR基因在鸡不同组织内的表达水平和分布情况,为进一步研究VLDLR在肿瘤发生中的变化提供依据。采集成年鸡骨骼肌、肺脏、脂肪、脾脏、肝脏等组织,提取RNA,根据Gen Bank中的鸡VLDLR基因序列设计引物并进行RT-PCR扩增,检测鸡5种组织中VLDLR基因的相对表达水平。结果显示VLDLR基因在鸡不同组织间的表达存在差异,表现为肌肉表达量最高,肺脏和脂肪组织次之,肝脏表达量最低。相对表达量由高到低依次为骨骼肌(10.95±0.14)、肺脏(3.87±0.23)、脂肪组织(3.02±0.11)、脾脏(2.31±0.08)和肝脏(1.00±0.17)。本试验证实VLDLR基因在肺脏有较高的表达量,脾脏也有一定的表达。     

鸡Mx基因2032位点单核苷酸多态性研究

研究采用错配PCR-RFLP的方法对15个品种鸡的Mx基因进行筛查,旨在探索不同鸡品种MxcDNA第2032位点抗病基因A与易感等位基因G的多态性,为生产转基因鸡的可行性提供理论基础。结果表明:15个鸡品种Mx基因的2032位点存在A、G2个等位基因,AA、AG、GG3种基因型,其中鹿苑鸡、狼山鸡、斗鸡未发现AA型个体,茶花鸡、红色原鸡未发现GG个体;携带Mx抗性基因A和易感基因G的比例分别是0.350、0.650;抗性等位基因A的检测比例为0.034~0.984。红色原鸡的抗性等位基因A基因频率(0.984)高于地方鸡种的抗性等位基因A的基因频率(0.321);地方鸡种中的观赏型、蛋肉兼用型、肉用型、蛋用型鸡种的抗性等位基因A的基因频率分别为0.221、0.297、0.425、0.462。χ2适合性检验表明,15个品种的鸡群均处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

四种云南地方鸡胸肌脂肪酸的比较分析

为了研究不同鸡种和性别云南地方鸡胸肌中脂肪酸的差异,以黎明鸡(公28只、母30只)、尼西鸡(公22只、母26只)、青花鸡(公28只、母30只)、无量山乌骨鸡(公26只、母29只)的胸肌为研究对象,采用索氏抽提法测定胸肌粗脂肪、采用气相色谱法测定胸肌中18种脂肪酸,比较同鸡种不同性别、同性别不同鸡种胸肌18种脂肪酸的差异。结果表明:四个品种鸡的母鸡粗脂肪含量均极显著高于公鸡(P0.01),黎明鸡粗脂肪含量显著高于尼西鸡和无量山乌骨鸡(P0.05)。四种鸡胸肌中脂肪酸含量较高的是C16∶0(棕榈酸)、C18∶0(硬脂酸)、C18∶1n-9c(油酸)、C18∶2n-6c(亚油酸)、C20∶4(花生四烯酸)。黎明鸡不同性别间SFA、UFA含量和18种脂肪酸总含量差异不显著(P0.05),性别对其他三种鸡饱和脂肪酸(SFA)、不饱和脂肪酸(UFA)含量和18种脂肪酸总含量均有影响。无量山乌骨鸡母鸡必需脂肪酸(EFA)含量极显著高于公鸡(P0.01),其他三种鸡EFA含量在性别间差异不显著(P0.05)。黎明鸡18种脂肪酸总含量显著高于尼西鸡、青花鸡和无量山乌骨鸡(P0.05)。     

8周龄中外鸡种心肌、肝脏组织差异表达基因的初步分析

本文利用mRNA差异显示技术对8周龄中国地方品种丝毛乌骨鸡、引进品种白莱航蛋鸡、白洛克肉鸡进行基因差异表达分析。结果表明：三个品种鸡的心肌、肝脏组织分别检测到18和20条差异表达的基因片段。其中，心肌组织中的差异表达片段在白莱航蛋鸡与白洛克肉鸡之间最多，肝脏组织中的差异表达片段在丝毛乌骨鸡与白洛克肉鸡间最多。实验结果为寻找产蛋、产肉及肉质性状相关的基因提供了遗传学基础信息。     

Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的表达研究

为了探讨Piwil1基因在鸡生殖系干细胞中的生物学功能,本研究以原始生殖细胞和精原干细胞为细胞模型,利用Real-time qPCR技术检测了Piwil1基因在如皋黄鸡生殖系干细胞中的相对表达量。结果表明,Piwil1基因在生殖系细胞中特异性表达,且Piwil1基因在精原干细胞中的表达量显著高于原始生殖细胞,这表明Piwil1基因可能在精原干细胞的"DNA重新甲基化"以及自我更新过程中发挥重要作用。