3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病(MD)毒株目前的流行情况,在我国3个已免疫MD疫苗的白羽肉种鸡场暴发MD的鸡群中,通过临床剖检,组织病理学变化,病毒分离,IFA检测从发病鸡的淋巴细胞中分离到3株马立克氏病毒(MDV),并分别命名为SDAU1501、SDAU1502和SDAU1503。采用PCR方法扩增3株MDV的vIL8、pp38、meq致病基因,所得氨基酸序列与已发表的参考毒株序列进行比较分析,结果显示SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株的同源性达到97%以上,具有强毒特征;而SDAU1503的meq基因在第194位具有与CVI988同样的缺失(P),但其没有CVI988中177个核苷酸的插入突变,其具有与弱毒疫苗株的特征。MDV新的变异在不断发生,出现了不同类型的变异株,因此,对MD的流行情况与基因监测应当继续下去;同时,在MDV疫苗的研制更新上还有待于进一步研究。     

鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒血清1型（MDV1）引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病,MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近几年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗“814”株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡,采用双重实时荧光定量PCR（FQ—PCR）方法,检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示,接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1（10^2.6 copies～10^5.2 copies／10^6 cells）;在检测期间,淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势,总体呈现不规律变化,而且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加,14d～21d达到峰值,超强毒株峰值处病毒载量可达到10^7 copies／10^6 cells,峰值期病毒载量是感染前期（1d～7d）的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株,即复制能力高于弱毒株。研究表明,MDV1国内流行的毒株有增殖速度快,病毒载量高的新特点;MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低呈正相关。     

芦花鸡REV与MDV混合感染的诊断分析

从山东某鸡场收集临床有发病表现的发病鸡只,采取新鲜组织样品,分离DNA,做PCR检测.用细胞培养和间接荧光抗体试验的方法从这些病料中同时分离到了禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和马立克氏病病毒(MDV),通过组织病理学检查的方法表明该鸡场的疫病为REV和MDV共感染引起的肿瘤病.     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。     

用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV MDV和REV

为研究鸡传染性贫血病毒(CAV)在鸡群中的感染状况以及马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮细胞增生病病毒(REV)在鸡群中的发病率，用斑点杂交法对山东省4个肉鸡场和2个肉种鸡场进行CAV、MDV和REV的检测，结果表明除一个肉种鸡场没有检测出REV以外，其他鸡场均同时检测出CAV、MDV和REV，并且发现直接从病科中检测CAV的阳性率(20％)远远低于将病科接种SPF鸡胚后的检出率(80％)。     

鸡马立克氏病的流行与免疫

鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的鸡淋巴细胞增生性肿瘤疾病。其特点是在鸡外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤出现淋巴样细胞、单核细胞的浸润和增生及肿瘤的形成。鸡马立克氏病病毒（MDV）归属于疱疹病毒科。MDV在流行过程中经常出现变异毒株，其共同特点是毒力比一般毒株强，有极强的肿瘤性，用HVT免疫的鸡不能阻止其致瘤性。MDV分3个型，Ⅰ型为致病性强毒株及其致弱毒株，Ⅱ型为无致病性的自然弱毒株，Ⅲ型为火鸡疱疹病毒（HVT），此型病毒本非MDV，但因与鸡马立克氏病关系密切，故将其划分在马立克氏病毒型内。     

免疫鸡感染马立克氏病病毒的诊断

采用细胞培养和免疫荧光试验从河南某种鸡场已免疫马立克氏病疫苗的产蛋期发病肉种鸡中成功分离到一株马立克氏病病毒,命名为MDV/He N15。用PCR方法对其pp38、meq和g B基因进行序列分析,与Gen Bank参考序列比较发现,分离株meq和pp38基因与Ⅰ型MDV毒株的同源性分别达到99.0%~99.8%和99.8%~100%,g B基因序列与参考株GX0101序列完全一致,基因上具有强毒特征。表明在免疫过疫苗的鸡群中仍然存在MDV强毒感染的风险。     

整合进禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒的分离鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从曾免疫过CVI988/Rispens株疫苗的患马立克氏病(MD)肿瘤的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV,命名为GXY2株。用禽肿瘤病聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对患鸡的肿瘤组织病料及克隆纯化毒株的DEF培养物进行检测,结果均扩增到MDV-1强毒株的132-bpr特异性带和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)。用基于抗MDV-1的gB蛋白单克隆抗体BA4、MEQ蛋白单克隆抗体3G12E6和抗REV的单克隆抗体11B118分别对毒株的培养物进行间接免疫荧光试验(IFA),结果样品只与抗MDV-1的单克隆抗体呈现阳性反应,而与抗REV的单克隆抗体呈现阴性反应。应用PCR技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,结果发现其序列与我们之前分离鉴定的MDV-1野强毒株G2和YL040920高度同源。研究的结果表明,分离株GXY2为整合有REVLTR片段的重组MDV强毒株。     

ALV与MDV混合感染造成鸡群临床肿瘤暴发的诊断

2017年11月,广西某公司两个商品鸡群出现鸡只食欲不振、排绿色粪便症状。病鸡解剖发现内脏有肿瘤发生,采集肿瘤组织和外周血淋巴细胞分别进行病理组织学观察、病毒分离以及PCR鉴定,结果显示两批鸡均为J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus sub-group J,ALV-J)与马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)的混合感染。从每群发病鸡分别获得的2株ALV-J和2株MDV的基因序列测定与遗传进化树分析结果显示,4株ALV-Jgp85基因相似性为100%,均与广西分离株GX15MM6-2的亲缘关系最近,而与NX0101的距离相对较远。4株MDV之间meq基因相似性为99.0%~99.9%,其中1株与MDV标准强毒GA在同一个分支,另外3株与广西分离的MDV超强毒GXY2、GX0101距离最近且在同一个分支,都具有MDV-1型强毒株的特征。     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明,其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示,HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株,这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示,虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。     

地方品种JS鸡多发肿瘤病的病原学分析

为探究江苏地方品种JS鸡种易发肿瘤病的原因,本研究从病原学方面进行相关分析。通过剖检发现JS鸡疑似发生肿瘤病;观察组织切片发现禽白血病病毒(ALV)、马立克病毒(MDV)引起其的特征性病变;分别应用2对可区分MDV野毒和疫苗毒的鉴别引物、1对ALV群特异性引物、5对可区分不同亚型ALV的鉴别引物,以及3对网状内皮组织增生症病毒(REV)特异性引物对病料样品和细胞培养物进行PCR检测;同时,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测培养细胞中的禽REV,ELISA检测细胞上清中ALV-p27抗原。检测结果显示,鉴定出的MDV为血清1型MDV野毒,ALV为J亚型(ALV-J),REV为阴性。采集同群发病鸡血液分离MDV、ALV-J,将获得的病毒株人工接种1日龄SPF鸡,感染后5 d自实验鸡血液中分离到MDV、ALV-J,表明该分离株可感染SPF鸡,具有良好的生物学活性。本研究从JS品种鸡中检测到了致瘤性病毒MDV和ALV-J,这可能是该品种鸡肿瘤病多发的主要原因之一,这一研究结果对JS鸡肿瘤病的防制提供了科学依据。     

一株鸡马立克氏病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

吉林省某地区鸡马立克氏病（MD）疫苗免疫鸡群暴发MD,从发病鸡羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞生长的马立克氏病毒（MDV）。该毒株感染无特定病原体（SPF）鸡可引起典型的MD临床症状：对非免疫鸡和火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗免疫鸡的致病率分别为76％和72％,二者无显著差异,表明HVT疫苗对该毒株不能提供有效保护。通过对该毒株病毒基因组中132bp重复序列、meq基因的核苷酸及推导的氨基酸序列分析,发现该毒株的132bp重复序列的拷贝数、meq基因的变异符合高毒力MDV毒株的特点。     

缺失部分miRNA的重组马立克氏病病毒致病性研究

马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的T淋巴细胞增生性疾病.为了研究MDV编码的miRNA与致瘤性的关系,通过对缺失部分miRNA的MDV-MS毒株进行动物感染试验,并将其结果与MDV-MS强毒株的致病性的试验结果进行比较.结果表明:缺失miRNA的重组MDV对无特定病原体(SPF)鸡无致病性,而接种MDV-MS毒株的SPF鸡却显示出很强的MD典型症状.此结果证实MD V编码的miRNA对MDV的致瘤性起到重要的作用.另外,通过对重组MDV感染鸡的羽髓病毒载量的动态检测,发现此处编码MDV-miRNA的基因为复制非必须区,但重组病毒rMS△miR9-12比亲本病毒MDV-MS的体内复制能力有所下降.     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,共分离鉴定出2株MDV I型毒株,分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-),具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时,JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变,pp38蛋白出现L98I和F240S突变,而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变,pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此,2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征,同时存在新的基因突变。     

山东蛋鸡群马立克病临床病例的综合诊断及流行毒株的分子特征分析

2019年5月份以来,山东省各地蛋鸡场送诊的疑似鸡马立克病(Marek's disease,MD)的临床病例明显增多,为明确诊断并探究其发病原因,本试验采用病理剖检、组织病理学观察、病毒分离鉴定等实验室诊断方法进行综合诊断并对分离毒株的分子生物学特性进行分析。剖检病死鸡的心脏、肝脏、肺脏、肾脏表面均见灰白色肿瘤病灶,脾脏颜色变淡、显著肿大。镜检发现在各器官组织内浸润性生长的肿瘤组织为大小不等的淋巴样瘤细胞并多见核分裂象。分离到3株马立克病病毒(MDV),分别命名为SDHZ1、SDLC1、SDTA1,采用PCR方法扩增分离毒株的Meq、gE及gI基因,并与参考毒株相应序列比对,结果显示分离毒株的Meq基因编码的氨基酸在77E、80Y、115A和176R位点均有相同的氨基酸突变,与中国的参考强毒株GX0101、Js201801相同,且Meq基因编码的氨基酸的176位氨基酸突变(P→R)改变了原有的Pro重复序列,这可能与vvMDV的毒力有关。分离毒株MDVs与已报道的中国毒株的gE和gI基因突变位置相同,具有明显的地域性遗传特点。经过遗传进化分析,分离株MDVs与GX0101的同源性最高,属血清1型MDV且极有可能是超强毒株。但MDV分离株的致病性及鸡群免疫失败的原因有待于进一步研究探讨。     

禽白血病A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病诊断

采用病理组织学方法和分子生物学技术对某肉种鸡场的感染鸡进行实验室诊断,在肿胀的肝、肾和法氏囊组织切片中观察到成淋巴细胞增生病变。针对禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原P27基因进行RT-PCR扩增,肾、肺、肝、脾病料样本中ALV病原核酸的检出率分别为100%、100%、90%和50%。将扩增的目的基因序列与GenBank公布的ALV参考毒株相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性达到93.6%~97.7%。取ALV囊膜糖蛋白gp85基因的扩增产物进行酶切分析,扩增的目的片断中存在BglⅡ和SspⅠ酶切位点,BamHⅠ不能切割PCR产物。试验结果证实本次疫病是由ALV-A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病。     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒

本研究建立了鸡马立克氏病血清1型病毒（MDV1）绝对定量检测方法。研究中选择MDV1特有的Meq基因的一段保守序列作为检测对象，将其克隆到质粒载体中，作为阳性标准品；同时将管家基因．鸡卵铁转蛋白（Ovo）特异性基因片段克隆到质粒载体上作为内参照的标准品。经荧光定量PCR（FQ-PCR）法扩增获得MDV1的FQ-PCR两条标准曲线，建立了MDV1双重FQ-PCR检测方法。应用该方法绝对定量检测了实验攻毒鸡及吉林省某地发病鸡只的羽髓、淋巴细胞等组织样本中单位细胞病毒拷贝数，并与琼脂扩散（AGP）、常规PCR等检测方法进行比较。结果表明，不论实验攻毒鸡还是自然发病鸡，羽髓中病毒富含量均高于其它组织，每百万宿主细胞内病毒含量为10^7～10^8拷贝；FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP，达100％；该方法的灵敏度比常规PCR检测高10～100倍，在单位细胞内可灵敏地检测到2．78个拷贝的病毒。该方法可以在不同的样品中有效的绝对定量检测MDVl。