重组产气荚膜梭菌plc毒素基因植物乳酸杆菌的构建

依据乳酸菌的肠道益生作用,选择产气荚膜梭菌关键致病因子α毒素/磷脂酶C为抗原,构建产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段重组植物乳杆菌,利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc重组蛋白相对分子质量分别为40 kDa。重组质粒pSIP409-plc分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明,构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌plc蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。     

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌疫苗免疫的组织学研究

为了评估表达产气荚膜梭菌NetB毒素的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗对鸡的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。设置3组免疫组雏鸡,于7~28日龄分别连续免疫pSIP409空载体植物乳酸杆菌、pSIP409-Net B重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;设置4组攻菌组雏鸡,免疫方法同上,免疫后于43~47日龄连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫组不攻菌只口服等量PBS对照)。通过免疫后肠道分离重组菌、病理组织学检查疫苗对雏鸡组织器官有无损害作用及保护作用;攻菌后细菌分离计数、剖检肠道病变评分来评价疫苗的免疫水平。结果显示,免疫后2周仍可在免疫鸡的小肠、盲肠段分离到重组菌;组织学检查发现与对照组相比重组疫苗的免疫没有对雏鸡组织器官产生损害作用;NetB攻菌组的肠道损伤情况较空载体攻菌组和PBS攻菌组轻微;NetB攻菌组的肠道病变评分低于空载体攻菌组和PBS攻菌组。表明所构建的重组口服活菌疫苗安全有效,结果为重组植物乳杆菌表达系统作为口服疫苗应用提供了理论依据。     

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌疫苗免疫保护性研究

为了评估表达产气荚膜梭菌NetB毒素的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗对鸡的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。免疫组雏鸡分为3组,于7~28日龄分别连续免疫p SIP409空载体植物乳酸杆菌、p SIP409-NetB重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;攻菌组雏鸡免疫方法同上,于43~47日龄连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫对照组和不攻菌只口服等量PBS对照组)。通过采用ELISA检测抗体动态变化,观察雏鸡体重变化和免疫器官发育情况以评价疫苗的免疫效果。结果显示,NetB组特异性抗体Ig G和s Ig A水平随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫对照组存在显著或极显著差异(P0.05或P0.01);NetB攻菌组各项指标在短暂下降后很快升高,且明显高于未免疫对照组雏鸡(P0.01)。NetB组周增重14日龄后均高于其他组,且35日龄开始与其他组差异极显著(P0.01);攻菌组体重变化总趋势是NetB攻菌组最高,其次是空载体攻菌组(P0.05),PBS攻菌组最低(P0.01)。免疫组在免疫结束时胸腺和脾脏指数呈明显上升趋势,NetB组的这两项指数分别在56日龄和49日龄达到最高,法氏囊指数在28日龄下降,随后稳步上升;虽然攻菌后各免疫器官指数上升趋势变缓,但NetB攻菌组的各项指数在各时间点均与其他组差异极显著(P0.01)。表明重组口服活菌疫苗对产气荚膜梭菌攻击雏鸡起到很好的保护作用,所构建的重组疫苗安全有效,结果为重组植物乳酸杆菌表达系统应用于口服疫苗提供了理论依据。     

表达猪白细胞介素2(pIL-2)重组乳酸杆菌的构建

为了建立表达猪白细胞介素2(pIL-2)的重组乳酸杆菌,用PCR的方法从pMD-18T-pIL-2质粒中扩增pIL-2基因,并送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序分析。将测序正确的PCR扩增产物与pSIP409表达载体链接,通过PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。将重组载体电转至乳酸杆菌,通过SDS-PAGE电泳和Western Blot的方法鉴定pIL-2蛋白的表达,通过细胞粘附实验检测重组乳酸杆菌对猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞的粘附性。结果显示,通过PCR和酶切的方法鉴定pMD-18T-pIL-2质粒中基因大小与pIL-2基因大小相似,吉林省库美生物科技有限公司测序结果与Gen Bank上pIL-2基因100%吻合。通过SDS-PAGE电泳和Western Blot的方法鉴定,重组乳酸杆菌表达蛋白为pIL-2蛋白。重组乳酸菌可使猪肠道上皮细胞IPEC-J2结构紧密,细胞间粘连蛋白表达量增多。表明重组乳酸杆菌表达的蛋白为猪白细胞介素2(pIL-2)蛋白。     

CTB-CPA融合基因构建、表达及其产物的免疫原性

构建成含有编码霍乱毒素B亚单位 (CTB)和产气荚膜梭菌α毒素 (CPA)第 70～ 370位氨基酸的融合基因CTB CPA ,并在大肠杆菌中获得表达。经限制性内切酶鉴定和核苷酸序列分析表明 ,CPA基因在重组质粒中与CTB基因的连接向位是正确的 ,位于CTB基因的下游并与CTB基因处于同一阅读框架。重组菌株BL2 1(DE3) (pECTB CPA)经IPTG诱导后 ,其表达产物经SDS PAGE和Western blot检测表明 ,重组菌株可以表达CTB CPA融合蛋白。表达的产物以包涵体的形式存在 ,可分别被抗CT和A型产气荚膜梭菌抗毒素识别 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 7%。用表达产物免疫小鼠后 ,所产生的对A型产气荚膜梭菌毒素攻击的免疫保护力高于用单独的A型产气荚膜梭菌类毒素免疫的小鼠所产生的免疫力 ,证明所表达的融合蛋白中CTB起到免疫佐剂的作用 ,增强CPA的免疫原性     

表达产气荚膜梭菌α—β融合蛋白基因工程菌株的构建

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中护增出α毒素基因，用NcoI和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0.95kb的α毒素基因片段，再用NcoI和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXETB2，与上述回收的α毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中。经NcoI、BamHI、NotI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE3）（pXCPAB2）经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的22.14%。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，免疫小鼠至少能抵抗2MLD的C型产气荚膜梭菌的攻击。这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXCPAB2)可以作为预防仔猪红痢基因工程菌苗的候选株。     

表达A亚群禽白血病病毒Gp85蛋白的乳酸菌的构建

本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增ALV-A Gp85蛋白的编码基因gp85,将树突状细胞靶向肽（DC-targeting peptide,DCpep）编码基因与gp85基因进行融合,获得gp85-DCpep基因;使用乳酸菌锚定表达载体pSIP409-pgsA’通过同源重组的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85;经测序正确后将上述质粒分别电转化植物乳杆菌NC8感受态细胞,获得重组植物乳杆菌;使用SppIP诱导重组植物乳杆菌的表达,收集处于对数生长期的菌体,通过反复冻融获取细胞膜的蛋白样,采用Western blotting技术检测pgsA’-gp85-DCpep和pgsA’-gp85蛋白的表达情况。结果显示,试验成功获得基因片段gp85和gp85-DCpep,构建的重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85测序无突变和丢失情况,并成功电转到植物乳杆菌NC8感受态细胞中,使用SDS-PAGE和Western blotting技术在细胞膜蛋白样中检测到蛋白的表达,大小分别为48.3（pgsA’-gp85-DCpep）和47 ku （pgsA’-gp85）。本试验成功构建了重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85,获得的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和NC8-pSIP409-pgsA’-gp85中的蛋白均成功表达,且具有反应原性,为后期深入研究重组植物乳杆菌在抗ALV-A感染中的保护机制奠定良好的基础。     

OEPR法构建含不同破伤风毒素T细胞表位的CPB表达质粒及其产物的初步鉴定

为了提高产气荚膜梭菌β毒素(CPB)亚单位疫苗的免疫效果,试验将不同破伤风毒素辅助性T细胞表位引入该蛋白前,用OEPR(Overlap Extension PCR and Recombination)法构建了8个重组表达质粒(即p Cold-CPB、p Cold-P2-CPB、p Cold-P21-P30-P2-CPB、p Cold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB和p ET22b-CPB、p ET22b-P2-CPB、p ET22b-P21-P30-P2-CPB、p ET22bP32-P23-P21-P30-P2-CPB)。将阳性重组质粒转入到大肠杆菌中,以自诱导培养基表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,8个重组菌均成功表达出目的蛋白,且大小均与预期一致。Western Blotting检测结果表明,重组蛋白均可被C型产气荚膜梭菌阳性血清识别。毒性试验结果表明,重组蛋白均可致死小鼠。本研究首次用OEPR法成功构建了8个含不同破伤风毒素T细胞表位的产气荚膜梭菌β毒素表达质粒,并成功表达了目的蛋白,为探索破伤风毒素辅助性T细胞表位对产气荚膜梭菌β毒素免疫效果的影响及进一步开发亚单位疫苗奠定了基础。     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21(DE3)pXMCPA02表达条件的优化

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α 毒素突变基因的表达情况.经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确.同时以IPTG为诱导剂诱导α 毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化.优化表达的结果是:培养基pH7.5,培养温度37 ℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%.从而实现了α 毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据.     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是：培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

乳糖诱导剂对重组C型产气荚膜梭菌α毒素基因表达的影响

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素基因的重组质粒,用SDS—PAGE检测不同条件下α毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXETA02含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。结果表明,以乳糖诱导α毒素基因表达的优化条件为：培养基pH7．0,培养温度37℃,菌体生长密度D600达到1．0时分批添加0．5g／L乳糖,诱导5h,此时目的蛋白表达量为23％,实现了α毒素基因的高效表达。从而为C型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的高效表达

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中扩增出α毒素基因，用NcoⅠ和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0．95kb的α毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXCPAB2，与 回收的α毒素基因片段连接，转化至受菌BL21（DE3）中。经NcoI,BamHI,NcoI酶反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE）3（pXCPAB2)经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDSPAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合基因，该融合蛋白占菌体总蛋白的22．14％。     

OEPR法构建mETX-mCPA表达质粒及其重组蛋白的免疫效果评价

为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。     

重组产气荚膜梭菌plc基因植物乳酸杆菌的免疫效果评价

为了评估表达产气荚膜梭菌α毒素plc基因的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。免疫组雏鸡分为3组,于7~28 d分别连续免疫p SIP409空载体植物乳酸杆菌、pSIP409-plc重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;攻菌组雏鸡免疫方法同上,于43~47 d连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫组不攻菌只口服等量PBS对照)。通过病理组织学检查疫苗对雏鸡组织器官的损害作用; ELISA检测抗体动态变化、攻菌后细菌分离计数、剖检肠道病变评分、雏鸡体重变化和免疫器官发育情况来整体评价疫苗的免疫水平。结果显示,与对照组相比重组疫苗的免疫没有对雏鸡组织器官产生损害作用,plc特异性抗体IgG和s IgA水平检测显示,抗体水平随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫组有显著和极显著差异(P 0.05,P 0. 01);攻菌后免疫组雏鸡各项指标在短暂下降后很快升高,且明显高于未免疫组雏鸡。攻菌组各项试验也证明,我们的重组口服活菌疫苗对产气荚膜梭菌攻击雏鸡起到很好的保护作用。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的构建

用PCR从含产气荚膜松菌β毒素基因的质粒pXETB2中扩增出β毒素基因，NcoⅠ和BamHⅠ双酶切该β毒素基因，回收0.93kb的β毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含产气荚膜梭菌α毒素基因质粒pXETA1,与上述回收的β毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经NcoⅠ，NotⅠ酶切反应鉴定和苷酸序列分析证实，获得的重组质粒pXCPAB1含有α－β融合基因，重组菌株BL21（CD3）（pXCPAB1)表达产物经ELISA检测和SDS－PAGE分析，表明重组菌株可以表达α－β融合蛋白。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆、表达及其抗血清的制备

本试验通过设计并合成1对引物,PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株α毒素完整成熟肽序列,并将其插入到pGEM-T Easy载体中,构建克隆载体pGEM-T-α。对克隆载体pGEM-T-α进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ的双酶切,将得到的1125 bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys宿主菌中,37 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为46.1 ku,与预期大小一致。Western blotting结果显示,该重组α毒素蛋白可被A型产气荚膜梭菌定型血清识别,表明该重组α毒素蛋白具备与天然毒素相似的反应原性。重组α毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和超声波裂解沉淀中均有分布,且以包涵体表达为主,表明重组α毒素蛋白可同时在胞外、周质和胞浆表达。小鼠毒力试验结果表明,重组α毒素蛋白不具有毒性。毒素—抗毒素中和试验结果表明,该抗血清具有α毒素特异性。以重组α毒素蛋白作为抗原免疫家兔制备血清,效价测定结果表明每1 mL重组α毒素蛋白抗血清可以中和100 MLD的A型毒素。     

产气荚膜梭菌重组NetB毒素细胞毒性作用研究

坏死性肠炎B样毒素(NetB)是新近发现的由产气荚膜梭菌产生与鸡坏死性肠炎发生密切相关的成孔毒素。本研究通过观察NetB毒素对HeLa细胞以及小鼠肠道的毒性损伤作用,进一步阐明该毒素在鸡坏死性肠炎发病过程中的作用。采用PCR方法扩增NetB毒素基因片段,构建重组表达质粒pGEX-NetB并转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达获得重组NetB蛋白,纯化鉴定后用复性的蛋白质进行HeLa细胞毒性试验。结果如下:光镜观察可见,NetB蛋白作用2h后,部分细胞出现肿胀变圆,少数细胞破裂,细胞质外溢;12h后,细胞已无正常形态,细胞圆缩,细胞因坏死脱落溶解空隙增大,偶见病变细胞聚集成团;48h后,细胞坏死明显,只残存细胞溶解后的碎片。HE染色后观察可见病变细胞染色不均,细胞膜碎裂而不完整,细胞质外溢。电镜观察可见,病变细胞缺少完整的细胞膜结构,细胞质外溢,细胞核形状不规则,核膜膨出,核仁边集,亚细胞器也出现不同程度的病变,其中线粒体病变最为明显。通过对小鼠病理模型观察可见,接种NetB毒素小鼠发病迅速,腹部膨大,肠道臌气明显;组织学观察表明接种小鼠内脏器官出现不同程度的病理变化,以小肠最为明显,表现为肠黏膜损伤,绒毛断裂、脱落等。NetB毒素可引起HeLa细胞细胞膜损伤而呈现细胞毒性;小鼠体内试验NetB毒素可复制出NE典型病变,表明NetB毒素与NE的发病密切相关。     

产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备

为了制备产气荚膜梭菌致病性毒力因子α毒素的单克隆抗体,试验采用PCR法获得α毒素基因,克隆入原核表达质粒p ET-30b,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,构建表达α毒素的重组菌BL21/p ET-30b-α;IPTG诱导重组菌表达,并进行SDS-PAGE分析,以纯化的重组α毒素蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠,经筛选、亚类鉴定及特异性试验检测单克隆抗体。结果表明:重组菌表达的α毒素蛋白分子质量约为43 ku;杂交瘤细胞株3C5能够稳定分泌抗α毒素单克隆抗体,单克隆抗体亚型为Ig G2a型,能够特异识别产气荚膜梭菌天然α毒素蛋白。说明制备的单克隆抗体具有良好的反应原性。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。     

产气荚膜梭菌β毒素的表达及其抗血清的制备

PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株β毒素完整成熟肽序列,将942 bp的基因片段以正确的阅读框架定向克隆于p ET-32a(+)中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21(DE3)中,在37℃1 mmol/L IPTG诱导下该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为54.6 ku,与预期值一致。Western blot显示,该重组蛋白可被C型产气荚膜梭菌血清识别,表明该重组蛋白具备与天然毒素相类似的反应原性。重组β毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和包涵体中均有分布,且以包涵体为主,表明重组蛋白可同时以胞外、周质和胞浆的形式表达。小鼠试验表明,重组β毒素蛋白不具有毒性。毒素-抗毒素中和试验表明,该抗血清具有β毒素特异性。以重组β毒素蛋白作为抗原免疫家兔,每0.1 m L的一免、二免、三免后抗血清分别可以中和10、20、50个小鼠MLD的C型毒素。结果表明,试验所获得的重组菌株有望成为产气荚膜梭菌β类毒素生产的候选菌株,所制备的抗血清有望进一步研制成为抗β毒素国家标准品。