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《中国预防兽医学报》2015,(12)
为分离鉴定广东某养鸭场疑似"肝坏死"病例的病原,本研究将采集的病料样品感染番鸭胚及番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病原分离,提取出现细胞病变培养物的核酸,采用宏基因组学方法,以随机引物反转录并合成双链DNA进行PCR扩增,扩增产物进行分子克隆和测序分析。结果显示:F6代分离的病毒滴度为log10~(5.0)TCID_(50)/m L,能够导致9日龄~11日龄番鸭胚死亡及MDEF产生明显细胞病变。50个随机克隆经Gen Bank检索有28个为鸭2型腺病毒(DAd V-2)同源序列,核苷酸同源性为92%~99%。28个同源序列形成8个毗连序列群,共计15 107 bp,覆盖DAd V-2基因组全长的34.54%,分离株与Gen Bank中唯一的DAd V-2 GR分离株亲缘关系最近,其部分hexon基因编码的氨基酸同源性为83.3%。参照测定序列设计的引物能够特异性扩增病毒基因。本研究首次应用宏基因组学分离获得国内首株DAd V-2,也是迄今除了法国以外国内首次报道的DAd V-2分离株。 相似文献
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近年来,新发人畜共患病呈现逐年递增的趋势,人类想要征服新发人畜共患病,就必须提前发掘潜在的新的致病性病原,并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、致病机制及疫苗开发等方面的研究。病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术,该技术结合深度测序技术(第二代、第三代测序技术)已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒,该技术不依赖于病毒培养及病毒序列,在国内外被广泛应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。就病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展进行了介绍。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(6)
为了解宁夏野鸟携带病毒的自然本底和多样性,发现潜在感染人或畜禽的病毒,本研究利用病毒宏基因组学技术对在宁夏石嘴山市、中宁市和青铜峡市采集的14种119只野鸟粪便样品进行了分析。提取全部样品核酸,经随机引物扩增后进行Illumina高通量测序,利用SOAPdenove软件将获得的32 385 000个读长(reads)拼接成163 192个重叠序列(Contig),再与NCBI病毒数据库中的序列进行比对,分析样本中病毒的种类及丰度。通过序列注释分析显示,0.4%重叠序列与病毒相关,能够进一步注释到19个病毒科,其中63%的病毒序列为噬菌体,33%的为脊椎动物病毒,3%的为昆虫病毒,1%的为植物病毒,在注释到的脊椎动物病毒中包含有禽流感病毒、札幌病毒等人畜共患性病毒。本研究结果丰富了野鸟携带病毒的基础数据资源,同时提示宁夏地区野鸟存在传播一些重要人兽共患病的潜在风险。 相似文献
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利用二代高通量测序技术建立检测鸭源样品中坦布苏病毒的方法。首先将样品过滤和经核酸酶处理,再利用等温链位移扩增(SPIA)技术快速制备样品总cDNA,最后经磁珠纯化和文库构建后,通过Ion Torrent进行高通量测序获得基因组信息。结果显示,通过SPIA扩增和核酸文库制备的优化,可从微量病原样本中获得327pmol/μL的核酸文库样本。Ion Torrent测序共获得1 725 436条reads,约6.2M数据,平均109bp。数据拼接并Blast发现,病原样品的核酸序列可注释鸭坦布苏病毒全部基因组数据,与首次发生在我国的鸭坦布苏病毒BYD-1株参考序列的同源性为100%。将所测病毒序列与其他5种黄病毒科成员进行同源性比对,发现与近3年发生在我国的鸭坦布苏病毒同源性最高,在98%以上。且NS基因进化树分析与鸭坦布苏病毒处于同一分支上,符合鸭坦布苏病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序检测方法,可同步获知坦布苏病毒基因的核酸信息。 相似文献
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为了解人工瘤胃模拟装置发酵内环境变化规律,将新鲜采集的牛瘤胃液按比例按比例加入到人工瘤胃模拟装置中,分组发酵培养6 h、12 h、18 h和24 h后,分别测定pH及发酵产气量,并提取不同培养时长瘤胃液样本总DNA,使用Miseq2×300 bp平台对样本16S rRNA基因V3~V4、18S rRNA基因V4区扩增产物测序,进行微生物宏基因组学分析。结果表明:随着发酵时间延长,瘤胃pH不断下降,发酵总产气量整体呈上升趋势,且12 h内呈现显著性变化(P<0.05);针对瘤胃发酵液中原核型微生物和真核型微生物类群进行的宏基因组测序结果分析表明,发酵培养12 h的样本中微生物物种丰度及群落多样性指数处于较高水平,与0 h发酵样本差异显著(P<0.05),且随培养时间延长,群落多样性整体呈下降趋势,普雷沃菌属的物种丰度最高,均毛属为瘤胃纤毛虫优势种属。值得注意的是,瘤胃液中尚存在许多未被鉴别分类,且相对丰度较高的微生物,需要进一步研究。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(7)
为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。 相似文献
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猪圆环病毒3型可引起猪的皮疹、呼吸系统和泌尿系统功能障碍等。快速、准确地检测PCV3对于保障猪的健康和生产具有重要意义。本文综述了当前国内外已报道的PCV3快速检测方法,主要包括免疫学检测方法 (酶联免疫吸附试验、免疫层析技术)、基于PCR的方法 (常规PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR、数字PCR及其他基于PCR的技术)、等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶介导等温核酸扩增、重组酶聚合酶扩增、酶促重组等温扩增以及聚合酶螺旋反应)、原位杂交技术以及宏基因组测序技术。本文还初步探讨了不同方法的原理、特性及优缺点,展望了未来PCV3快速检测方法的发展方向,以期为快速、精准地检测及科学防控PCV3提供参考。 相似文献
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宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科,主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足,是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域,并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。笔者对宏基因组学的主要技术方法及其应用研究进展进行了简要综述。 相似文献
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下一代测序(NGS),也被称为深度、高通量或大规模并行测序,可一次同时测定几十万到几百万条核酸分子序列。在畜禽疫病中应用于复杂诊断和密集监测、病因学、基因组学、进化和流行病学,以及宿主-病原体相互作用和感染生物学等方面。本综述首先简要介绍了深度测序技术,并通过实例对深度测序在畜禽疫病诊断中的应用进展进行阐述,为今后的相关研究提供些许参考。 相似文献
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核酸检测技术是目前动物疫病诊断和食品安全监测的重要手段。多重核酸检测技术可同时检测多种病原,具有通量高、损耗低的优势,在疫病诊断和食品安全监测等领域的应用越来越广泛。目前已研发出多种多重核酸检测技术,包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)多病原核酸检测技术、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)多病原核酸检测技术、生物芯片多病原核酸检测技术、高通量测序多病原核酸检测技术等。由于检测原理不同,不同方法之间的检测性能存在较大差异。本文通过概述基于PCR/RT-PCR、LAMP/RT-LAMP、生物芯片、高通量测序建立的多重核酸检测技术,全面分析其在动物疫病诊断和食品安全监测领域中的特点和具体应用策略,以期推进病原检测技术的创新和发展,为动物疫病诊断及食品安全监测提供技术支持。 相似文献