优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文)

[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。     

反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR（IPCR）为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序称的技术体系，该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA；总DNA用10倍过量的限制性内切酶在50μL反应体积中进行过夜酶切；酶切片段在20μL体积中进行自连接，之后进行套式PCR（nested-PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR结合了热启动PCR和降落了PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法，本实验室在一周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300－750bp之，PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明，实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。     

反向PCR技术克隆猪H-FABP基因5''侧翼序列

H-FABP被作为猪肥胖性状的候选基因之一.利用反向PCR技术克隆得到猪H-FABP 5'侧翼启动子远端上游174 bp序列,将获得的序列与已有的相关序列进行核苷酸序列同源性比对,获得71 bp新序列,为猪H-FABP基因功能的进一步研究提供理论基础.     

转基因大豆及其深加工产品的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了从大豆及其深加工产品中检测转基因成分的方法。大豆及其深加工产品采用改良的CTAB法进行DNA提取纯化,大豆色拉油DNA则用试剂盒方法进行了提取纯化。对提取的DNA用PCR方法对大豆特异性内源基因lectin进行扩增,设计CaMV35启动子和NOS终止子特异性引物对其是否含有转基因成份进行初步的定性PCR筛选,并用抗除草剂基因CP4EPSPS对阳性结果进行确证。实验结果表明,改良的CTAB法对大豆深加工产品的DNA有很好的提取效果,而试剂盒方法对色拉油的DNA有良好的提取效果;PCR检测转基因的方法快速高效,检测结果与标准相符。     

反向PCR鉴定piggyBac介导的哺乳动物细胞转基因研究

利用反向PCR技术,研究piggyBac介导的转基因哺乳动物中外源基因整合位点信息.首先在转座子piggyBac中插入巨细胞病毒(CMV)启动子元件驱动的绿色荧光蛋白基因(EGFP),构建用于转染哺乳动物细胞的转基因载体pXL - CMV - EGFP;同时构建以CMV启动子驱动的转座酶基因载体.将2种载体以脂质体共转...     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

 利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。     

转基因水稻种子中外源元件的PCR检测

基因重组技术突破了传统育种所遇到的一些障碍，能够准确、快速地把目的基因导入寄主细胞中，从而赋予寄主以抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、延熟等优良特性，或使其营养品质得到改善。但转基因农作物潜在的风险还是一个尚待研究的领域，有关转基因植物对环境安全、生物物种安全、人类安全与健康的影响尚无定论。各国都纷纷针对转基因产品的贸易制定了相应政策，并建立了许多转基因产品的检测方法［1，2］。 水稻是一种重要的粮食作物。自1988年第一批水稻转基因植株问世以来，中国、日本、泰国、德国、菲律宾、瑞士、英国、加拿大等国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，许多转基因水稻品系已进入田间试验。预计在不久的将来，转基因水稻将实现商品化［3］。因此，有必要建立快速、简便、灵敏的转基因水稻种子检测方法。     

转基因抗除草剂油菜相关基因的PCR检测及其在育种中的应用

以抗草甘膦杂交油菜三系和抗草丁膦杂交油菜二系亲本及其F1杂种为材料,探索建立和优化抗草甘膦的CP4、gox基因和抗草丁膦的bar基因及其Barnase、Barstar基因的PCR检测方法,为转基因抗除草剂油菜的品种选育、F1种子纯度鉴定和转基因油菜的生态安全性研究提供可靠、实用的检测方法。     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

转基因甘蓝型油菜的小孢子培养及转基因的遗传分析

[目的]研究甘蓝型油菜转查尔酮异构酶反义基因T1代植株及其小孢子成苗的遗传表达,为甘蓝型油菜的转基因和种质资源创新研究提供参考。[方法]以甘蓝油菜转查尔酮异构酶反义基因T1代5个独立转基因植株为材料进行小孢子培养,通过GUS报告基因的组织化学染色鉴定对外源转基因在花粉植株中的遗传进行了分析。[结果]5个独立转基因植株均获得了胚状体和花粉植株;转基因在花粉培养后代和有性自交后代中遗传行为一致;在每个独立转基因植株的花粉植株中GUS阳性和阴性的分离比均为3∶1,符合孟德尔遗传规律,表明有2个转基因拷贝整合到受体2条非同源染色体上;3个独立转基因植株自交后代中GUS阳性和阴性的分离比符合15∶1,同样表明有2个转基因拷贝整合到受体2条非同源染色体上。[结论]通过转基因油菜的小孢子培养快速获得转基因纯系是可行的。     

甘蓝型油菜籽粒RNA提取方法的探讨

用CTAB法、SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒分别提取甘蓝型油菜花后40 d的籽粒RNA.用电泳法和A260/A280与A260/A280的比值比较提取RNA的质量.结果发现:用SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒都没有成功提取RNA,只有CTAB法成功地提取出了完整的甘蓝型油菜籽粒RNA.用CTAB法提取的总RNA的A260/A230与A260/A280的值分别为2.06和1.94,说明采用该方法提取的RNA污染小,纯度较高,获得的RNA产量也较高.通过逆转录实验和基因片段的克隆也证明获得的RNA质量比较高,可以直接满足一般的分子实验.     

甘蓝型油菜BnaSOT12a基因的抗性作用研究

磺酸转移酶(SOT,EC2.8.2.–)催化的磺酸化反应在植物的生长发育和植物抗逆过程中起着重要的作用。甘蓝型油菜BnaSOT12a基因是与拟南芥中AtSOT12基因同源的一个磺酸转移酶基因。为探寻BnaSOT12a基因的抗性相关功能,对其在油菜中不同部位的表达和在拟南芥中过表达情况下对转基因植株的影响进行了分析。结果显示:BnaSOT12a基因在甘蓝型油菜的根、叶、花芽和花中都有表达,其在花中的表达量最高,而在茎与果荚中没有表达;甘蓝型油菜BnaSOT12a基因在拟南芥中的过表达,能提高转基因植株在发芽和根生长方面对NaCl胁迫的耐受能力,但在盐胁迫下,BnaSOT12a的磺酸化作用并不影响拟南芥中抗病途径的信号传导,与抗病途径无关。     

不同硼效率油菜品种细胞壁果胶硼的结合位点

用果胶酶水解油菜上部叶细胞壁中提取的果胶，用二乙氨乙基(DEAE)—琼脂糖(Sepharose)色谱柱层析分离含硼化合物，研究硼在不同硼效率甘蓝型油菜品种(Brussica na pus)细胞壁果胶中的结合位点。结果表明：硼在不同油菜品种、不同提取剂提取的果胶酶解液中均只有1个色谱峰，该峰与鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ(RG-Ⅱ)的特种糖残基-3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)色谱峰重合，所有酶解液中硼和KDO出峰的位置基本相同，只是峰的高低不同，证明RG-Ⅱ可能是硼在油菜细胞壁中的唯一结合位点，RG-Ⅱ在不同油菜品种细胞壁中的结构基本相同，但含量不同。     

青藏高原白菜型油菜与甘蓝型油菜远缘杂交亲和性研究

为研究青藏高原白菜型油菜与甘蓝型油菜远缘杂交的亲和性,对白菜型油菜与甘蓝型油菜及配制的正反交组合的杂交结实率和亲和指数进行测定,并对杂交F_1代形态学、花粉活力和自交亲和性分析。结果表明:白菜型油菜与甘蓝型油菜杂交,以甘蓝型油菜作母本,结实率和亲和指数较高;甘蓝型油菜与白菜型油菜正反交F_1代组合均表现为自交亲和,植物学性状均偏向于母本,自交亲和性表现为甘蓝型油菜F_1(甘蓝型油菜×白菜型油菜)F_1(白菜型油菜×甘蓝型油菜)白菜型油菜,自交亲和指数分别为20.37、6.30、1.59、0.51,花粉活力表现为甘蓝型油菜白菜型油菜F_1(甘蓝型油菜×白菜型油菜)F_1(白菜型油菜×甘蓝型油菜)。     

应用高稳系数法分析油菜新品种的高产稳产性

用高稳系数(HSC)法分析1999—2000、2000—2001、2001—2002年度江西省油菜区域试验22个参试品种(系)的高产稳产性，并与常规的几个评价高产稳产的统计参数进行对比和相关分析，结果表明：高稳系数是一个比较理想的衡量油菜品种高产稳产性的综合指标，计算简便，可用性强。     

甘蓝型油菜叶片与种子硫甙相关性研究

 【目的】研究甘蓝型油菜叶片与种子硫甙在不同生育时期的变化规律，分析叶片硫甙与种子硫甙相关性。【方法】采用高效液相色谱技术测定了甘蓝型油菜叶片与种子硫甙含量和组分。【结果】高硫、低硫甘蓝型油菜叶片硫甙含量变化规律显著不同，高硫油菜中油821叶片硫甙苗期含量最高，达33.15 ?mol·g-1，在随后的生育时期其硫甙含量持续下降；而低硫材料从越冬到现蕾逐渐升高，薹期降低，初花期又升高，盛花时降到最低。高硫品种中油821和其它低硫品系在薹期叶片硫甙含量接近，分别为7.63和6.55 ?mol·g-1，为甘蓝型油菜抗性改良和菜-油兼用型品种选育提供了参考依据。【结论】所有供试低硫材料叶片硫甙组分含量与种子硫甙组分含量间相关性均不显著，改变叶片硫甙含量不会显著影响种子中硫甙含量，脂肪族硫甙含量是高硫、低硫材料叶片硫甙总含量差异的主要原因。     

1个新油菜核不育系败育机理研究

[目的]研究1个新油菜核不育品系的败育机理。[方法]油菜现蕾后,取核不育系和可育系油菜花朵进行花器观察与比较,并用光学显微镜和电子显微镜对其花药发育进行显微和超微结构观察与比较。[结果]花器观察表明,油菜核不育系不育株的株型、株高等特征以及花器结构与正常株无显著差别,花药前期发育正常,后期逐渐萎缩败育,雌蕊发育正常。显微观察表明,核不育系的败育时期在花粉母细胞阶段,表现为花粉母细胞空泡化、细胞分裂的同步化丧失、细胞解体。超微结构显示,花粉母细胞的败育始于花粉母细胞分化期,细胞内出现许多自噬体和多泡体,并最终导致细胞解体。[结论]该核不育系的胞间通讯能力显著低于正常油菜,可能是导致其细胞分裂同步化丧失的原因。