应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了1对引物，建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明，PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析，与已报道NZ—2株的核苷酸序列同源性高达97％。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒，结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的。     

羊传染性脓疱病毒的分离鉴定

为了对羊传染性脓疱病毒的分离株ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树,本研究应用犊牛睾丸细胞从病羊痂皮病料中分离获得了1株羊传染性脓疱病毒,命名为Orf-ys,在电镜下观察到了典型的病毒粒子。应用PCR方法扩增获得了2条基因片段,PCR产物克隆至pMD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明Orf-ys的2个基因分别与参考毒株的相关基因核苷酸同源性高达97.6%～98.6%和96.9%～98.4%。基因进化树比较显示,与美国OV-IA82株和意大利OV/C2、OV/mi-90株的进化关系最近。     

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞,从内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到一株病毒,对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验,在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等,初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。     

山羊传染性脓疱病毒的鉴定

上海某养羊场羔羊唇部及哺乳母羊乳房和大腿内侧无毛部发生血红色小丘疹。从形成的痂皮中分离到1株病毒, 经电镜观察和动物接种试验, 证实该病毒为山羊传染性脓疱病毒。     

羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析

羊传染性脓疱严重威胁肉羊产业的健康发展和人民群众的身体健康.选取湖北某羊场疑似传染性脓疱病料,经电镜观察、病理切片染色、特异性目的基因扩增和序列测定鉴定为羊传染性脓疱病毒.序列遗传进化分析表明研究鉴定的传染性脓疱病毒与2007年分离于中国台湾毒株(DQ904351)同源性达100%,与印度2004到2005年分离于绵羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)的传染性脓疱病毒同属于1个进化分支.提交并公布于GenBank的B2L基因序列为分子流行病学研究积累了资料.     

羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析

为了确诊疑似羊传染性脓疱病例,分析羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)的分子特征,作者以湖北某羊场疑似传染性脓疱病料为对象,进行了电镜观察、病理切片染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果在电镜下观察到ORFV样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,自病料中扩增出特异性目的ORFVB2L基因片段(GenBank序列号GU320351)。结果表明该病例为黑山羊传染性脓疱病毒引起,序列遗传进化分析表明该病毒和2007年分离于中国台湾的毒株(DQ904351)遗传关系最近,和印度2004到2005年分离于绵羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)的ORFV同属于一个进化分支。本研究为ORFV分子流行病学研究积累了资料。     

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞，从我国内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到1株病毒，对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验，在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等，初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。     

羊传染性脓疱口炎病毒株的分离鉴定

利用牛肾(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)细胞对上海市崇明区某羊场的痂皮病例进行病毒分离,获得一株羊口疮病毒(orf virus,ORFV),命名为ORFVSH-01。参考NCBI数据库中ORFV的保守基因B2L的序列,设计一对特异性引物,进行PCR扩增并测序。结果表明：接种病料悬液的MDBK细胞出现细胞病变,成功分离到毒株;经PCR扩增和测序,分离的毒株为ORFV,命名为ORFVSH-01。     

羊传染性脓疱皮炎病毒的细胞培养

在确定内蒙古白音锡勒牧场羊传染性脓疱皮炎的基础上,我们利用犊牛睾丸细胞培养白音锡勒牧场传染性脓疱皮炎病毒(Orf virus)获得成功,现将培养方法介绍如下。     

羊传染性脓疱的诊断与防治

羊传染性脓疱又称羊口疮,是由传染性脓疱病毒引起的主要威胁绵羊和山羊的接触性传染性脓疱性皮炎,其特征是口唇等处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡,并最后结成疣状厚痂,羔羊最为敏感,并可能死亡。现结合我县王来富养殖场羊传染性脓疱的诊治情况,在此浅谈一下此病的防疫措施。     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus,ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞（LT）,并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID₅₀测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）;大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1 137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%~100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID₅₀值为10^-5.68/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

[目的] 确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法] 无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts,GSFs）培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果] 3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒（orf virus,ORFV）粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1 137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NM-ORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789（中国）疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论] 内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。     

羊传染性脓疱病毒感染山羊皮肤成纤维上皮细胞差异表达miRNA分析

旨在研究羊传染性脓疱病毒（orf virus,orfv）感染山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts cell,GSF）对GSF细胞microRNA（miRNA）表达谱影响,探究miRNA在orfv感染过程中的作用及调控机制。分别提取感染和未感染orfv的GSF细胞总RNA,构建miRNA文库,利用高通量测序技术进行miRNA差异表达分析,对差异表达miRNA靶基因进行预测,并进行GO和KEGG分析,随机选取10个差异miRNA进行RT-qPCR验证。结果显示,orfv感染组和未感染GSF细胞组相比共有678个显著差异表达的miRNA（fold change≥1.5）,其中,上调表达miRNA有509个,下调表达miRNA有169个,uniq_miRNA的Venn图分析显示,感染组和对照组共有的miRNA仅占8.21%;GO和KEGG分析显示,差异表达miRNA主要参与脂质代谢、受体及细胞因子信号转导等细胞生物学过程,RT-qPCR验证结果与高通量测序结果一致。本研究结果表明,orfv感染GSF细胞对其编码的miRNA有显著影响,获得大量GSF细胞编码的与orfv感染相关的差异miRNA,为进一步从宿主miRNA层面揭示orfv感染和致病机制提供了参考依据。     

羊口疮病毒威海株的分离鉴定

利用犊牛睾丸原代细胞对山东省威海市某奶山羊养殖场疑似羊口疮（Orf）山羊病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、病毒滴度和聚合酶链反应（PCR）等方法对分离毒株进行鉴定。结果表明,研磨处理的病毒液接种于犊牛睾丸原代细胞后盲传至第5代出现病变,测得第6代分离株病毒滴度为106．5 TCID50／mL。扩增羊口疮病毒特异性 B2L 基因,发现该毒株与34个羊口疮毒株核苷酸序列同源性高达99％,包括福建株（KC588399．1、KC568398．1）。本研究成功分离鉴定了羊口疮病毒山东威海株。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定。参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059 (F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96%以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd。     

马立克氏病病毒的分离和鉴定

从长春、天津、大连地区分离到10株马立克氏病病毒(MDV),经电镜观察、琼脂扩散试验、痘斑及蚀斑形成试验,均符合MDV的特点.通过MDV单克隆抗体、鸡胚细胞培养及致病性试验等鉴定,10株病毒均为血清I群MDV.火鸡疱疹病毒疫苗对其中的C-4株的保护率低于京-1株(P<0.01),而对其它株的保护率与京-1株差异不显著(P>0.05).     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及应用

根据NC-005336 ORFV全基因中gORF011设计合成一对引物。建立用于检测羊传染性脓疱病毒的PCR方法。此方法检测羊传染性脓疱病毒结果与病毒分离培养,电镜检查结果一致。经过对扩增产物进行序列分析,与NC-005336 ORFV的核苷酸序列同源性高达97.48％。通过特异性,敏感性及临床应用实验证明,此方法可以检测10^4ICID50浓度病毒;临床应用检出率为94．7％,显著高于病毒分离培养36．8％的检出率;并能与羊痘病毒,口蹄疫病毒鉴别;此方法用于检测羊传染性脓疱病毒是特异的、敏感的、可行的。     

杨凌某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

为获得杨凌地区羊口疮病毒野毒株,在某羊场采集具有典型羊口疮症状的病羊口唇部结痂并研磨,无菌过滤后取500μL接种于犊牛睾丸原代细胞。盲传4代,测定细胞病变的第5代病毒的滴度,用羊口疮病毒B2L和F1L基因的特异性引物进行PCR检测。结果显示,第5代病毒能够致犊牛睾丸原代细胞出现细胞病变(CPE),病毒滴度为107.66 TCID50/mL;扩增出了羊口疮病毒B2L和F1L基因的片段,其大小分别为540bp和437bp,与用于设计引物的参考毒株序列的相似度分别为96.57%和96.43%,可确定为羊口疮病毒的相应基因片段,获得了羊口疮病毒分离株。     

Isolation and Identification of Orf Virus in Chongqing Area,and Prokaryotic Expression of F1L Gene

The assay was aimed to isolate,culture and identify Orf virus (ORFV) in Chongqing area,and investigate the expression of the F1L gene sequence in E.coli,the virus in the scab samples collected from suspected ORFV infected lamb was isolated in MDBK cell.Moreover,the F1L gene was amplified by PCR and ligated into pET-32a for expression in E.coli.The recombinant plasmid pET-32a-F1L was constructed with the introduction of restriction enzymes NotⅠand EcoRⅠ.The isolated virus was ORFV.SDS-PAGE analysis and Western blotting showed that the target protein was highly expressed with 57.4 ku in lenght at 5 h in E.coli as inclusion bodies and had good reactivity.