转基因大麦中gfp基因的遗传及表达研究

为了探索转基因遗传及染色体重组对转基因表达的影响,以4个转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦系与野生型大麦相互杂交,通过对F<,2根尖和花粉细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的检测,研究了转基因的遗传方式和表达.结果表明,绿色荧光蛋白基因在单位点和双位点插入的转基因系与野生型大麦杂交的F<,2群体中分别表现3:1和15:1的遗传分离,符合孟德尔式遗传,并表现基因的剂量效应;不同转基因系问相互杂交后代同样表现孟德尔式遗传,并出现转基因gfP表达水平提高的个体;转基因沉默系参与的杂交后代继续表现其转基因沉默.     

根癌农杆菌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白基融合因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200µmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。     

核糖体基因GmRPL12对大豆低硫耐性的调控作用研究

为研究大豆中核糖体基因对大豆耐低硫胁迫功能的调控作用,从科丰1号根中克隆1个大豆核糖体蛋白编码基因GmRPL12。分析基因结构和低硫胁迫下不同组织中的表达情况,将基因过表达载体和干扰载体转化科丰1号毛状根,获得转基因嵌合体,并进行基因表达分析和植株表型分析。序列分析结果表明:基因编码区全长576 bp,预测蛋白C端包含1个核糖体蛋白L7/L12保守结构域RPL12。该基因在根中表达量较高,表达水平受低硫诱导,不同品种中该基因对低硫响应的模式不同。通过毛状根遗传转化获得GmRPL12基因过表达、RNA干扰以及空载体对照的大豆嵌合体。低硫处理与正常硫水平处理相比,GmRPL12基因过表达的大豆嵌合体植株倒一叶和倒二叶SPAD、株高、地上部鲜重和干重、地下部鲜重和干重显著增加,RNA干扰下调大豆嵌合体植株的以上指标。GmRPL12基因的过量表达能显著增加低硫处理时地上部、地下部的无机硫含量,以及正常硫水平处理时地上部的无机硫含量。研究结果暗示GmRPL12基因可能参与大豆对低硫耐性和大豆硫代谢的调控。     

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α'亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α'亚基基因RNAi重组植物表达载体p CAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α'亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明:成功构建β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1~2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

大豆fad3c基因沉默载体的构建

构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。     

HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化

大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。     

GFP绿色荧光法辅助筛选玉米转基因植株

利用GFP(Green Fluorescence Protein)绿色荧光蛋白基因作为辅助性筛选标记基因,基因枪法轰击玉米自交系A188和Qi319未成熟胚的胚性愈伤组织。瞬间表达实验结果表明,轰击后GFP表达可持续近20 d,轰击后10 d左右表达量仍保持在较高的水平。采用潮霉素筛选、GFP荧光法鉴定,获得一批玉米转基因植株,转化频率为0.33%~0.47%。分子鉴定和后代分析的结果表明,外源基因已经整合到了玉米基因组中,并能够稳定地表达和遗传。GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象。     

抗虫基因Cry8-like在大豆中的遗传转化及抗虫性初步鉴定

利用无缝克隆技术把抗虫基因Cry8-like重组到pCAMBIA3301载体上,成功构建了含有抗草铵膦筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-RSP-Cry8-like-nos。将该载体通过农杆菌介导法转入两个受体大豆品种吉农28和吉农42中,经PCR检测,吉农28和吉农42分别获得了17株和13株T_1阳性植株,36株和25株T_2阳性植株。T_2转基因植株Southern杂交结果显示,目的基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR检测结果表明,Cry8-like在转基因植株幼根得到了表达,而非转化受体对照未检测到荧光信号。室内抗暗黑鳃金龟幼虫鉴定结果表明,转基因植株提高了抗暗黑鳃金龟幼虫的能力。     

大豆Kti基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建及转化

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,Kti)是大豆品质的主要营养抑制因子之一,培育低Kti含量的大豆品种是提升大豆品质的关键。本研究采用RT-PCR技术克隆得到大豆Kti基因的核心保守序列,并构建成种子特异性表达的、具有Kti基因反向重复结构的RNAi载体,利用农杆菌介导法侵染大豆品种吉林30子叶节,通过潮霉素筛选和PCR检测,获得4株转基因阳性植株。RT-PCR检测表明,构建的种子特异性RNAi载体可以在转基因植株的种子中特异表达,且Kti基因表达量均有降低;通过胰蛋白酶抑制剂活性检测发现,转基因大豆籽粒中胰蛋白酶抑制剂活性平均降低了77.5%。为进一步评价RNAi技术对大豆Kti基因的表达调控效果奠定良好基础。