农杆菌介导法将ACC合成酶和氧化酶反义基因转入日本甜柿的研究

以日本甜柿品种次郎(Diospyros kaki Thunb.cv.Jirou)的叶片为外植体,通过农杆茵介导法,建立了次郎柿遗传转化体系.结果表明,茵液OD600值为0.6,乙酰丁香酮浓度为200mg·L-1,筛选培养3 d,头孢霉素为300mg.L-1的转化率最高.在此条件下,将ACC合成酶和氧化酶的反义联合基因导入到次郎柿的组培苗中,经PCR检测,得到了8株转基因植株.     

上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究

为了得到耐贮藏的转基因柿,以上西早生柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC氧化酶的RNAi遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的壮观霉素浓度为30 mg/L,预培养时间为3 d,用OD600值为0.3的菌液侵染10 min、AS浓度100 mg/L、共培养4 d有利于提高转化频率。经PCR分子检测与GUS组织化学染色,初步确定ACC氧化酶基因已转入上西早生柿组培苗中。     

柿子脱涩

<正> 柿子可分为涩柿和甜柿两种,甜柿从树上摘下来就可食,如日本的次郎、富有、伊豆等品种;涩柿是因为果实里含有单宁。单宁使人吃了有涩感。柿子脱涩原理就是通过柿子内部的化学变化,分解所含单宁,去掉涩味。 柿子脱涩的方法很多,其中又分漤柿和烘柿,现介绍几种。1 清水漤柿 将成熟变黄的柿子从树上摘下来,装入竹篓或条筐,放入山涧溪流里,使水淹没柿子,经5～7天便可脱涩。如果采摘早,脱涩时间可稍长;采摘晚,脱涩时间可短     

固定化酵母酿造柿酒工艺及产品质量分析

以自选的凝胶包埋固定化SN S07酵母为发酵剂,探讨柿酒的最佳酿造工艺。结果表明:固定化包埋菌数为5.8×106cfu.mL-1凝胶,固定化细胞活化培养液采用66.7%麦芽汁和33.3%柿汁混合液,活化时间24 h;果酒发酵优化条件为固定化酵母加量为10%,20℃、pH 4.0条件下发酵时间8 d。对获得的不同批次柿酒产品进行品质指标测定,结果表明:酵母固定化发酵柿酒的各项指标一致性强,产品质量稳定,符合果酒质量要求;在此基础上提出了柿酒的质量标准,可为柿酒产品开发提供技术依据。     

柿种质资源对柿炭疽菌的抗性评价

柿炭疽病是柿树上的毁灭性灾害,本试验通过连续3年的自然发病调查和田间人工接种鉴定研究了14份柿种质资源和1份砧木对柿炭疽菌Colletotrichum horii的抗性。结果显示,不同种质资源的病情指数存在差异,田间自然发病病情指数在9.0~65.0之间,田间人工接种后病情指数在8.3~72.3之间。其中,野柿和浦城方柿病情指数低于10.0,发病较轻,属于抗病品种;涩柿八月黄、鲁柿5号和砧木君迁子感病指数10.0~30.0,为中等抗病水平;次郎、早秋和小萼子在田间自然发病时为中等抗病水平,但在田间人工接种时属感病品种;其余品种均为感病或高感品种。本研究可为柿抗炭疽病育种提供理论依据和育种材料。     

细枝木麻黄组织培养和转基因研究

[目的]对细枝木麻黄进行组织培养和转基因研究。[方法]以耐寒性细枝木麻黄为试验材料,探讨了转化受体选择压力、菌液浓度、共培养时间在愈伤组织诱导及不定芽分化方面对农杆菌介导转基因转化效率的影响。[结果]对细枝木麻黄不定芽诱导分化适宜的激素组合为DCR+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;转基因抗生素选择压力为潮霉素,共培养时间3 d;以初步建立的转基因体系利用农杆菌介导法获得94株转基因木麻黄,通过PCR检测,其中61株为PCR阳性植株。[结论]该研究为细枝木麻黄的组织培养和转基因研究奠定了基础。     

温水脱涩温度对柿果实营养成分和抗氧化活性的影响

为了解不同脱涩温度对柿果实中营养成分和抗氧化活性的影响。采用35、45和55℃温水对‘磨盘柿’和‘次郎,进行脱涩,测定果实中的单宁含量、类黄酮、VC、总酚以及ABTS自由基清除能力的变化。结果表明：不同温度处理,‘磨盘柿’果实中的总单宁含量变化介于20．11～25．36mg／g,而可溶性单宁、缩合单宁、类黄酮、VC、总酚以及ABTS自由基清除能力都呈下降趋势。其中35℃处理的磨盘柿果实可溶性单宁、缩合单宁、类黄酮和ABTS在16h明显下降,比45和55℃处理的滞后8h。而次郎果实中单宁含量、类黄酮、VC、总酚以及ABTS自由基清除能力变化不大并维持较低水平。本试验中发现‘磨盘柿’具有较强的抗氧化活性,但经过不同温度处理后,其营养成分和抗氧化活性会有极大程度地降低。     

柿果实多酚含量变化规律研究

系统地研究了湖南省主要柿品种果实的生长发育过程和多酚种类含量变化规律.结果表明:柿果实生长发育过程呈双S曲线;涩柿和甜柿各时期总酚的变化趋势基本一致,但涩柿的总酚含量比甜柿高,且涩柿多酚的下降速度慢于甜柿;以柿果实多酚的利用价值而言,9月上旬采集本地品种柿果实深加工比较合适,冷藏保存,时间不宜超过7 d.     

‘南通小方柿’DkADH1基因遗传转化及功能分析

[目的]研究‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.‘Nantongxiaofangshi’)乙醇脱氢酶基因DkADH1的功能,阐明其在柿果脱涩过程中的作用。[方法]构建了DkADH1基因植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将该基因转入番茄中。以转基因和非转基因番茄株系的不同组织为材料,钨酸钠-钼酸钠比色法测定可溶性单宁含量,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测原花青素(PA)合成途径相关基因的表达情况。[结果]经PCR和RT-PCR检测,获得了3个转DkADH1基因番茄株系。过量表达DkADH1基因的转基因番茄植株的叶片、花、果实中可溶性单宁含量均显著低于非转基因番茄植株。qRTPCR显示:转基因植株不同组织中PA合成途径相关基因F3’5’H、LAR、MYB4和PAL的表达量与非转基因植株相比均显著下调。[结论]DkADH1能降低植物可溶性单宁的含量并抑制其生物合成途径相关基因的表达,与柿果脱涩密切相关。     

《水果贮藏保鲜技术》讲座 第十五讲 柿子保鲜技术(下)

3.柿子脱涩　　柿子脱涩方法有两种,一种是采收前在树上已自然脱涩,如日本富有柿、次郎柿和罗田甜柿等。另一种是树上不能自然脱涩,必须经过人工处理等才能使柿子脱涩。由于品种不同,脱涩难易不同。采收成熟对脱涩也有影响,一般采摘早、成熟度低的柿果,脱涩较难。　　硬柿的脱涩方法：　　(1)温水脱涩法：将柿果装入缸内(不能用铁质)或铝锅内,倒入40℃温水,使柿果完全浸入温水中,密封缸口。控制水温维持在40℃下10小时～24小时可完全脱涩。温度低则脱涩时间延长(如10℃～20℃水温下3天～7天才能完全脱涩)。温度过高,柿果易被烫裂…     

转CP基因线辣椒对CMV的抗病性组分研究

以转化 CMV外壳蛋白基因 ( CP基因 )的线辣椒 ( Capsicum annuum var. longunt)为试材 ,系统研究了 CP基因介导抗病性的组分和表达特点。摩擦接种黄瓜花叶病毒 ( CMV,浓度 2 0μg/ ml)后 ,转基因线辣椒显症延迟 4～ 1 0 d,显症率和严重度大幅减低 ,仅部分植株表现轻度花叶。接种叶片上 CMV侵入位点数目比未转化对照品种减少 6 7.0 %～ 86 .4 %。接种后第 9天 ,转基因株系接种叶中 CMV含量仅为未转化对照的32 .4 %～ 37.3%。病毒由接种叶向邻叶转出始期 ,比未转化对照晚 9～ 1 5h。接种后 3d,转基因株系 1 6— 1 3的未接种叶中未能检出 CMV,而同期未转化对照已有 4片邻叶检出了 CMV。接种后 6 d,1 6— 1 3仅上下位相邻叶检出了 CMV,此时对照已全株带毒。转基因株系接种后 6 d,整株 CMV含量为未转化对照的 4 2 .5%。这表明线辣椒 CP基因介导的抗病性是多组分的 ,包括对病毒的抗侵入、抗扩展和抗增殖     

转CiNPR4基因柑橘抗溃疡病的机制解析

【目的】病程相关基因非表达子1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1)是水杨酸(salicylic acid,SA)介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚(Citrus paradisi)中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙(C. sinensis)抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc),统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸(jasmonic acid,JA)含量;同时,收集接种Xcc后0、...     

Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

【目的】探究ath-miR169d在拟南芥叶片发育过程中的作用,明确其调控的分子机制,为增强叶菜类植物的光合效率以及增加生物量和提高作物产量提供理论依据。【方法】选取ath-miR169d过表达和降低表达的拟南芥转基因株系以及野生型拟南芥,在22℃、相对湿度60%、16 h/8 h光周期条件下培养,观察不同生长阶段叶片发育表型的差异;同时构建pmiR169d::GUS表达载体,转化农杆菌EHA105,并利用蘸花法转化野生型拟南芥(Columbia,Col-0),获得转基因拟南芥,利用GUS染色对ath-miR169d在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行研究;选取8周龄的过表达材料和野生型对照株系,对其叶片表皮细胞形态进行扫描电镜分析;对4周龄过表达材料和野生型对照株系的幼苗顶端分生组织和叶片中总IAA进行定量分析,并进行基因芯片表达谱分析,筛选差异表达基因;通过实时荧光定量PCR对生长素信号途径部分差异表达关键基因的表达情况进行分析。【结果】Ath-miR169d过表达拟南芥株系莲座叶数目较野生型少,叶片小,而ath-miR169d降低表达的拟南芥株系的莲座叶较野生型多,叶片大,且在抽薹和种子成熟之后还持续长出新叶,而野生型莲座叶则在种子成熟之后逐渐衰老干枯;扫描电镜观察到ath-miR169d过表达拟南芥株系叶片中表皮细胞小于野生型;表达模式分析表明,ath-miR169d主要在顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)和叶片维管系统中表达,且新叶中表达强。SAM是产生生长素的部位,IAA测定结果表明ath-miR169d过表达拟南芥株系中IAA含量显著降低,为野生型植株的38.6%,同时基因芯片表达谱分析也验证了ath-miR169d参与调控植物体内激素信号转导途径。进一步研究发现,ath-miR169d过表达株系中生长素合成关键基因YUC2和转运体蛋白基因PIN1均显著下调表达,而具有转录抑制功能的生长素响应因子1和2基因(ARF1和ARF2)表达上调;STTM miR169d低表达株系中这4个基因的表达则为相反趋势,该结果与观察到的表型相一致。【结论】Ath-miR169d通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控,ath-miR169d表达量发生变化会影响叶片的数量和大小,最终影响整个植株的生物量。     

响应面法优化柿渣中单宁提取工艺

【目的】利用响应面法优化柿渣中单宁的提取工艺,为柿单宁的综合开发利用提供技术支持。【方法】利用溶剂浸提法提取成熟柿渣中的单宁,采用福林酚法测定柿单宁含量,选取pH（水浸提取法）、乙醇体积分数（乙醇浸提法）、料液比、提取时间和提取温度为因素,柿单宁提取率（Y）为响应值,在单因素试验的基础上进行Box-Behnken中心组合试验设计,建立回归方程,优化柿渣中单宁的提取工艺。【结果】3种提取方法获得的柿单宁提取率排序为:碱性水浸>酸性水浸>乙醇浸提。选用碱性水浸提取法作为提取工艺,建立的回归方程为:Y=1.75-0.0424A+0.0164B+0.0118C+0.01AB+0.0015AC-0.0005BC-0.2528A2-0.0003B2-0.0179C2（A为pH,B为提取时间,C为提取温度）;3个因素对碱性水浸提取柿单宁提取率的影响排序为pH>提取时间>提取温度,两因素间的交互作用对柿单宁提取率的影响均不显著（P>0.05）。最佳提取工艺条件:pH 11、料液比1∶3、提取时间129 min、提取温度96.5℃,在此条件下获得柿单宁提取率为1.75%,与理论预测值（1.76%）接近。【结论】采用响应面法优化柿渣中单宁的提取工艺稳定、可行,具有实用价值,可在生产实际中推广。     

不同处理方法对柿树枝条发芽的影响

[目的]通过低温和赤霉素处理探讨柿树枝条的休眠及发芽特性。[方法]以柿树枝条为试材,设置4个低温时数处理,在2~3℃低温下分别处理5、15、25、35 d,同时设置3个浓度的赤霉素液处理(100,200,300 mg/L),研究不同处理方法对柿树枝条发芽的影响。[结果]低温处理时数不同,柿树枝条发芽进度和发芽率有很大差别,其中以处理35 d的柿树枝条发芽最早,处理25 d的发芽率最高(63.98%)。用赤霉素处理的发芽试验中,3个浓度之间柿树枝条的发芽始期相同,发芽速度和发芽率无显著差异;但与清水浸泡对照相比,3个浓度的赤霉素处理使柿树枝条发芽始期均提前2 d,发芽率也有所提高。[结论]低温处理对柿树枝条打破休眠和提高发芽率效果明显,赤霉素对柿树枝条发芽没有显著影响。     

柿子酒液态发酵工艺条件优化研究

[目的]为提高柿子资源利用率,对柿子酒发酵工艺条件进行优化研究。[方法]该试验以柿子为主要原料,探究不同防褐变剂及添加量对柿子浆褐变的影响,并比较固态发酵和液态发酵2种发酵方式酿制柿子酒对其品质的影响。[结果]最佳的防褐变剂为柠檬酸1%;酒精发酵工艺的最佳方法为液态酒精发酵,其最优工艺参数为温度30℃、发酵天数7 d、接种量0.3 g/L、糖度200 g/L和p H 3.5。在此条件下酿造出的柿子酒,色泽明亮橙黄、柿香愉悦、酸味纯正、澄清透明、营养丰富。[结论]研究可为增加柿子的附加值,促进农业经济发展供理论依据。     

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度（6% PEG和8% PEG）的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量（鲜重和根长）及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。     

植物生长素合成酶iaaM基因在烟草韧皮部

为探讨生长素过度合成对植物韧皮部发育的影响,利用韧皮部特异表达的拟南芥蔗糖合成酶基因启动子与色氨酸单加氧酶基因(iaaM)重组,构建载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法将其转入烟草,获得了转化的烟草植株。大多转基因烟草都表现出叶片卷曲、植株生长异常的生长素过度表型。转基因烟草植株生长较野生型烟草(对照)植株明显迟缓,但其茎横切面韧皮部细胞显著增多,排列更加紧密整齐,木质部也较早开始分化。转基因烟草茎段有大量不定根分化,其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基,在不定根上有大量侧根和根毛的分化。     

拟南芥AtCOR15a转化烟草及后代抗寒性研究

【目的】研究拟南芥AtCOR15a基因的抗寒功能。【方法】构建pCAMBIA1301-COR15a的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗生素筛选和PCR检测获得转基因烟草。低温胁迫后,利用蒽酮法和酸式茚三酮法测定转基因烟草后代与野生型烟草的可溶性糖和脯氨酸含量,同时观察其抗寒能力。【结果】转基因烟草后代可溶性糖含量和脯氨酸含量均比野生型烟草有所提高,并在第5 d达到峰值。低温处理后转基因烟草后代能正常生长,而野生型烟草则全部死亡。【结论】生理生化指标的测定发现,可溶性糖含量与脯氨酸含量的变化趋势与烟草的抗寒性呈正相关,AtCOR15a基因导入烟草中可以明显提高烟草对低温胁迫的抵抗力。     

不同高CO2处理时间对保山甜柿货架期的影响

为探讨CO2处理对采后保山甜柿货架期的影响,首先对果实品质与货架期的相关性关系进行了研究,以期找出甜柿品质的快速、准确分级评定标准,并在此基础上以甜柿级别为评价指标探讨高CO2处理时间对甜柿果实货架期的影响规律。结果表明：品质指标中的硬度值与甜柿货架期的相关性最为显著,可作为评判甜柿采后级别的最快速、最直观的依据;高CO2处理有助于延长甜柿的货架期,且CO2处理时间越长,货架期越长,其中以CO2处理12 h后的甜柿货架期最长为45天,而CO2处理0 h的货架期仅为6天。