核桃GAI基因的克隆和序列分析

DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中一类重要的负调节因子。利用RT-PCR技术以香玲核桃叶片为试材,克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。对基因和编码蛋白序列进行分析,结果表明,JrGAI基因开放阅读框(ORF)为1 837 bp,编码612个氨基酸;生物信息学分析表明,JrGAI编码蛋白具有DELLA蛋白的典型结构域;利用BLASTx和DNAMAN软件进行相似性分析发现JrGAI编码蛋白氨基酸序列与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与辽宁2号核桃同源性最高,达到99%。核桃JrGAI基因的克隆为其进一步研究应用奠定了基础。     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

DELLA蛋白的研究进展

在已发现的植物赤霉素(GA)信号传递分子中,有一类N端具有高度保守的DELLA结构域,称为DELLA家族蛋白。介绍了DELLA蛋白的保守域结构、上游基因及降解。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

荔枝‘妃子笑’AP2同源基因的克隆及表达

根据笔者课题组荔枝基因组数据库,从‘妃子笑’荔枝中克隆了1个AP2同源基因LcANT,其cDNA全长2 087 bp,编码695个氨基酸,含有2个保守的AP2/EREBP结构域。生物信息学分析结果表明,LcANT含有7个内含子,亚细胞定位预测于细胞核,LcANT蛋白为疏水性蛋白,二级结构多为无规则卷曲。通过BLAST比对发现,LcANT与许多植物的ANT转录因子具有高度同源性,与开心果相似度最高,高达82%。利用q?PCR,对LcANT在‘妃子笑’荔枝中的表达模式进行了表征,发现其在春梢、秋梢和花序中表达量较高,暗示其可能参与调控花器官及其他植物营养器官的发育。LcANT基因的获得为后续研究其对荔枝营养器官生长发育的调控作用奠定了基础。     

海棠‘比利时垂枝’McRGL1a基因的克隆与分析

[目的]DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路一类重要的调节因子,具有抑制植物生长的生理功能.本研究从海棠品种‘比利时垂枝’中分离得到一个海棠DELLA蛋白家族基因McRGL 1a,并对其基因进行生物信息学分析,为进一步研究McRGL 1a在调控植物株高的生物学功能奠定基础.[方法]通过RT-PCR技术获得McRGL 1a基因的cDNA.应用多种生物学工具分析其序列特征.[结果]序列分析表明,McRGL 1a的cDNA长度为1 920 bp,编码639个氨基酸;McRGL1a蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;海棠McRGL1a与苹果DELLA蛋白同源性极高,都具有DELLA、TVHYNP等典型结构;系统进化分析结果表明McRGL1a可能在植物株高调控过程中发挥重要功能.     

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。     

火龙果类锌指蛋白基因片段的克隆及表达分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录的调控中发挥着重要作用.根据火龙果抗逆cDNA 芯片中的一个 EST设计一对引物,采用RT-PCR克隆火龙果类锌指蛋白基因片段,生物信息学分析表明,该片段长334bp,编码 1中含有109个氨基酸残基的肽链,命名为HuZF.该基因序列与其它植物锌指蛋白基因核苷酸序列的同源性均在 70%以上,推测的氨基酸序列与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列的同源性达60%以上.RT-PCR分析表明,高盐和 干旱胁迫下,火龙果茎中HuZF 的表达增强,低温胁迫时,HuZF 的表达先减弱后增强,初步推测该基因的表达与 火龙果低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关.     

‘凤丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表达分析

为克隆‘凤丹’(Paeonia ostii)花瓣衰老相关基因PoERF113的序列,分析其编码蛋白性质,探索其在不同发育时期花瓣、不同组织和不同品种的表达模式及对乙烯的响应,采用RT–PCR技术,从‘凤丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相关基因PoERF113。该基因属于AP2/ERF家族,其开放阅读框(ORF)为636bp,编码1个由211个氨基酸残基组成的蛋白,含有1个AP2保守结构域,不包含跨膜结构,蛋白相对分子质量约为53 000,理论等电点(pI)为5.13,为不稳定蛋白,具有亲水性;qRT–PCR分析结果表明,PoERF113基因在露色期、初开期、半开期、盛开期、始衰期、衰败期均有表达,主要在‘凤丹’露色期的花瓣和叶片中表达;在早花‘凤丹’突变株系中表达量最高;PoERF113基因在早花‘凤丹’突变株系与‘凤丹’中的序列相同,不存在碱基差异;PoERF113基因对乙烯有响应,其表达量随处理时间和生育进程的延长呈逐渐升高的趋势,推测该基因可能与乙烯诱导后导致花衰老进程相关。     

小菜蛾储存蛋白基因的克隆与表达分析

克隆和分析了2个小菜蛾的储存蛋白基因——Px AJSP-1和Px BJHSP-2.其中,Px AJSP-1属于芳基贮存蛋白,而Px BJHSP-2属于富甲硫氨酸储存蛋白.进化树分析表明,它们在同一目昆虫中相对保守.利用实时荧光定量PCR分析其表达模式,发现Px AJSP-1和Px BJHSP-2在4龄幼虫和蛹期高表达,且在脂肪体中的表达量远高于其他组织.     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1³个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏>肾脏>腮>脑>肌肉。     

花生GAIP-B基因的生物信息学分析及表达研究

为研究DELLA蛋白在花生生长、育种过程中的功能,利用RT-PCR技术从花生栽培种品系花2014中克隆得到一个花生DELLA蛋白编码基因AhGAIP-B(GenBank登录号:XP_016191184)。序列分析结果表明,AhGAIP-B开放阅读框(ORF)全长1 812 bp,只有一个外显子,可编码603个氨基酸。生物信息学分析发现,AhGAIP-B编码的产物是一类典型DELLA蛋白,其三级结构与拟南芥GAI相似,亲缘关系与大豆GmGAI1最近。进一步qRT-PCR结果显示,AhGAIP-B基因呈组成型表达,其中在茎中表达量最高;同时,本研究还发现,外源GA_3可以诱导AhGAIP-B基因上调表达,其表达量在处理后12 h最高。本结果将为进一步的花生DELLA功能研究提供理论基础。     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1~3个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏肾脏腮脑肌肉。     

青花菜病程相关蛋白基因 BoPR2 的克隆与表达

病程相关蛋白基因以家族形式存在于植物中,在抗病反应中起着重要作用。以青花菜为试材,利用PCR法克隆到1个PR2基因,定名为BoPR2。测序结果表明,BoPR2基因组全长1188bp,具1个内含子,编码区全长1092bp,编码351个氨基酸;序列比对和系统发育分析结果显示,BoPR2与野甘蓝、甘蓝型油菜和白菜PR2的相似度最高,在发育树上聚为一组,与亚麻荠、荠菜的相似度最低,亲缘关系最远;实时定量PCR结果表明,BoPR2的表达受芸薹根肿菌诱导,在10d时的相对表达量最大,约为对照的6倍;但BoPR2的表达不受核盘菌的诱导。BoPR2基因的克隆与表达分析,为青花菜抗病机理研究及开展分子育种奠定了基础。     

‘红阳’猕猴桃MYB基因的克隆与表达

为探讨MYB基因在‘红阳’(Actinidia chinesis‘Hongyang’)猕猴桃果实着色过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了‘红阳’猕猴桃的一个MYB转录因子基因。该基因的cDNA全长962bp,序列包含一个666bp的开放阅读框(ORF),编码221个氨基酸残基的蛋白质,其N端具有2个典型的MYBDNA结合域。同源性分析显示,该酶的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、番茄、金鱼草等植物中花青素途径相关的MYB转录因子基因的相似性都达到80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcMYB在‘红阳’猕猴桃中的表达量与花青素含量呈正相关,二者均在果实转色主要阶段维持较高水平,推测该基因在调控花青素合成的过程中起着重要作用。     

玉米病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础.     

苹果砧木‘SH6’中RGLs基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从苹果砧木‘SH6’中分离出三个DELLA家族基因RGL1b,RGL2a,RGL2b,为探究苹果DELLA蛋白家族对植株生长发育的调控机理,对这三个基因进行了生物信息学分析。【方法】通过克隆技术从苹果砧木‘SH6’中分离得到RGL1b,RGL2a,RGL2b的编码序列,利用生物学工具分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR方法分析其基因表达水平。【结果】序列分析表明,苹果砧木‘SH6’的3种RGLs序列具有较高相似性,均存在DELLA蛋白和GRAS家族的结构特征。但序列也存在部分差异,预测其编码的蛋白都具有亲水性能,RGL1b,RGL2a蛋白大部分定位在细胞质,而RGL2b主要分布在细胞核。用实时荧光定量PCR方法,检测了‘SH6’及其亲本‘国光’中这3种RGLs基因的相对表达水平,结果显示,RGL1b,RGL2a,RGL2b在‘SH6’中的表达量均明显高于‘国光’中的表达。【结论】苹果砧木‘SH6’中RGL1b,RGL2a,RGL2b基因可能在果树矮化中发挥重要作用。     

紫花苜蓿MsGAI的克隆、表达及遗传转化

【目的】 DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素（GA）信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】 利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系（L5、L8、L11）分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】 该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】 紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。