1株纤维素酶产生菌筛选及产酶条件优化的研究

1材料与方法1.1材料1.1.1主要仪器设备移液枪(20～200μL),全自动菌落计数仪,恒温水浴振荡器,数控超声波清洗器,立式电热蒸气灭菌器,电热恒温鼓风干燥箱,恒温培养摇床,紫外可见分光光度计,离心机等。1.1.2原料纤维素分解菌的分离原料来源于竹丛根部腐物,取自四川理工学院石鼓山竹丛。1.2培养基     

家蚕丝用琥珀酸脱胶的工艺条件优化试验

用有机酸脱胶剂对蚕丝进行脱胶,较使用碱性脱胶剂脱胶更为温和。采用琥珀酸对家蚕丝进行脱胶,通过单因素试验分析脱胶剂琥珀酸的质量浓度以及脱胶温度、反应时间和浴比对蚕丝脱胶效果的影响,获得较佳工艺条件为:琥珀酸质量浓度12 g/L,脱胶温度100℃,脱胶时间30 min,浴比1∶50。蚕丝在上述工艺条件下用琥珀酸脱胶的脱胶率为25.4%,与对照组(用4 g/L碳酸钠脱胶)的差异不显著;用琥珀酸脱胶的蚕丝,其断裂强力与断裂伸长分别比对照组的蚕丝提高2.5%和2.8%,红外光谱显示其丝蛋白的β-折叠结构的特征吸收峰变化不大,且α-螺旋结构含量减少,β-折叠结构含量有所增加;显微镜下观察用琥珀酸脱胶的蚕丝,其表面的沟槽较对照组蚕丝要少。试验结果说明,在优化的工艺条件下用琥珀酸脱胶,不仅对蚕丝有良好的脱胶效果,而且蚕丝的断裂强力损失与断裂伸长损失均较小。     

产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定。结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

一株真菌产酶条件的优化及发酵蛋白饲料的研究

试验研究了M-1真菌对小鼠的安全性、在3种液体培养基中的生长情况、产酶活力、产酶条件的优化及发酵蛋白饲料的影响,结果表明,这株真菌对小鼠是安全的;在缺乏氮源的液体培养基中能生长,但生长不良,而在含微量氮源的培养基和沙堡弱肉汤培养基中生长效果较好;该真菌能产淀粉酶和纤维素酶,而蛋白酶活性极低;发酵培养基组成为豆粕粉60%、麦麸35%、菜籽饼5%、营养盐[2%(NH4)2SO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.2%KH2PO4],料水比1:1.5,pH值自然,培养温度30℃,72h,相对湿度70%,发酵较佳,香味好,粗蛋白含量高。试验结果表明该菌株可以用于发酵生物蛋白饲料。     

一株高产内切纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌的产酶条件优化及酶学性质分析

试验旨在对一株杜仲树皮内生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的内切纤维素酶(CMCase)进行产酶条件优化及酶学性质分析,为探究贝莱斯芽孢杆菌CMCase的相关特性提供参考依据。采用单因子试验设计,分别优化pH、接种量、温度、时间、碳源和氮源等发酵条件,并探讨温度、pH、底物专一性、金属离子及表面活性剂对CMCase的影响。结果表明,以玉米秸秆为碳源(30 g/L)、豆粕为氮源(30 g/L)、3%接菌量、pH 7.0的条件下37℃培养48 h,贝莱斯芽孢杆菌157的CMCase最高可达(5.14±0.18) U/mL。经CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157的最适酶反应温度为60℃,最适pH为5.0;温度稳定性试验发现,在40和50℃时,相对剩余酶活力均高于80%,随着温度的升高,酶活力逐渐降低,当温度高于55℃,相对剩余酶活力约为50%;pH稳定性试验发现,在pH 5.0～10.0之间耐受性良好,相对剩余酶活力均高于90%,随作用时间的延长,相对剩余酶活力变化不大。贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase属于典型内切型纤维素酶。Na^+、Mg²⁺、Ca²⁺可促进贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase酶活力,而Co²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性剂Tween-80、Tween-20、Triton X-100对贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase无影响。本试验通过对贝莱斯芽孢杆菌157进行产酶条件优化及CMCase酶学性质分析发现,贝莱斯芽孢杆菌157 CMCase具有产酶量高,耐受pH范围广的特点,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸领域中具有一定的应用价值。     

一株乳酸片球菌的筛选、鉴定及其固态发酵饲料原料的产酸分析

本研究从猪的新鲜粪便中分离纯化出一株具有较强产酸效果的乳酸菌HF14,综合形态、生理生化、16SrDNA序列分析,初步鉴定该菌株为乳酸菌片球菌(Pediococcus acidilactici)。对HF14固态发酵豆粕、麸皮、玉米粉与稻壳粉等饲料原料的产酸类别进行分析发现,产生的有机酸以L-乳酸与乙酸为主,其中,发酵玉米粉的pH最低,为3.77,L-乳酸与丙酸含量最高,分别为21.91、1.03mg/g;发酵麸皮的pH降幅最大,丁酸含量最高,为0.72mg/g;发酵稻壳粉的乙酸含量最高,为6.15mg/g,L-乳酸含量最低;发酵豆粕的各个指标居中。     

产菊粉酶曲霉株的筛选和发酵条件的优化

70年代以来,国外就开始研究菊粉酶,我国在这方面的研究起步较晚。目前据国内外统计,产菊粉酶的丝状真菌有17个属40余种,酵母菌10个属20余种,细菌12个属10余种,其中大部分菌株产外切酶,青霉和少数曲霉产内切酶,而该研究均停留于实验室研究阶段,而且各菌株发酵获得的菊粉酶产量较低,生产成本高。     

淀粉分解菌的筛选及产酶条件的优化

研究旨在从马铃薯渣中筛选出一株酶活较高的淀粉分解菌,通过优化菌株的产酶条件来提高其淀粉酶产量,同时还测定了所产淀粉酶的酶学性质。根据菌体的形态和生化特征,初步鉴定为芽孢杆菌LZ-1;利用DNS法测定了淀粉酶的酶活,并优化了其产酶培养基。结果表明,最适培养基为:马铃薯淀粉2%、蛋白胨1%、硫酸镁0.05%、氯化钙0.05%、硫酸亚铁0.005%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾0.1%,pH值7.0。180 r/min,37℃摇床发酵48 h后,产酶量达到了58.63 U/ml。通过酶学性质测定,表明酶反应最适温度和pH值分别为70℃和6.0,在pH值4.0~8.0范围内稳定,当温度低于75℃时,热稳定性良好。该淀粉分解菌在设计发酵条件下能够产生较高酶活的淀粉酶,且所产酶具有较好的热稳定性和pH值稳定性。     

产有机酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及产芽孢条件优化

试验旨在筛选一株高产有机酸的芽孢杆菌,并对其芽孢形成条件进行优化。从实验室保藏的200株芽孢菌株中筛选能够使溴甲酚紫平板变黄的菌株。利用液相色谱对筛选所得的菌株发酵液中有机酸的种类、含量进行测定。根据目的菌株的形态特征和生理生化试验以及16S r DNA序列分析结果对菌株进行种属鉴定。利用单因素试验和正交试验结合的方法,考察不同的碳源、氮源、无机盐、p H值、培养时间、接种量对菌株芽孢形成的影响。结果表明,菌株R42-16发酵液中乙酸、乳酸的含量较高,分别为221、174μg/ml。经鉴定菌株R42-16为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amy-loliquefaciens)。本试验条件下,菌株R42-16的最佳培养基组成为:玉米粉1%、酵母浸粉2%、Mn SO4·H2O 0.01%、Ca Cl2·H2O 0.01%,培养基最佳初始条件为:发酵时间48 h、接种量4 ml、p H值6、装液量50 ml/250 ml。在此优化条件下,发酵液中菌株R42-16的活菌数达到3.19×109cfu/ml,芽孢形成率达到93.76%。     

短小芽孢杆菌B-15产酶条件的优化及酶学性质的研究

从本实验室分离短小芽孢杆菌B-15能降解羽毛角蛋白生产角蛋白酶,本试验对该菌株的产酶条件进行了优化.结果表明,在羽毛发酵培养基中,B-15产酶的最佳辅助碳源为葡萄糖.最佳辅助氮源为酵母粉,最佳接种量为2%,培养基最佳初始pH值为7.0,产酶最佳温度为30℃,最佳培养时问为48 h.在以上条件下培养,角蛋白酶活力可达2.03 U/mL,是优化前的2.5倍.对B-15所产的角蛋白酶进行了粗酶酶学性质的初步研究,结果表明.该酶最佳反应温度为55℃;最佳反应pH值为7.0;pH 5.5～8.0时酶活力较稳定,可达最大酶活力的70%以上.Mg2 对酶有激活作用,Fe3 对酶有抑制作用.羽毛被降解后,其残渣和发酵后的液体可以作为动物的蛋白饲料.     

一株桑树内生拮抗细菌的分离鉴定与抑菌活性

以大肠杆菌为指示菌,从野生型鲁桑(Morus multicaulis Perr.)桑树枝条韧皮部组织中分离得到具有抑菌活性的内生细菌ME1。形态与生理生化特性鉴定ME1菌株为有芽孢和鞭毛的革兰阳性菌,细胞呈杆状,大小为0.6～0.7μm×1.8～1.9μm;能够利用葡萄糖、蔗糖和乳糖等碳水化合物,所产淀粉酶活力可达4 182.60 U/g;耐盐性较高,可耐受100 g/L NaCl。进一步通过16S rDNA序列及其系统进化分析,初步鉴定ME1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。抑菌试验表明ME1菌株的代谢产物具有广谱抗菌活性,对大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)和白僵菌(Beauveria bassiana)的体外抑制率分别为59.92%、75.70%、51.60%、87.25%和69.81%,该菌株产生的抗菌活性物质具有潜在的医用开发价值。     

一株桑树内生拮抗菌的分离鉴定

从经过严格表面消毒的桑树根、茎、叶中分离获得内生细菌76株。以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为指示菌进行拮抗菌的筛选,其中5个分离株具有抑菌活性,复筛选出抑菌活性及热稳定性最强的G21菌株。进一步研究表明G21菌株对家蚕病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、绿僵菌(Metarhizium)均具有较强的拮抗作用。该菌株的形态及部分生理生化特征为:革兰阳性,杆状,产芽孢,接触酶阳性,好氧。16S rDNA序列分析表明该菌株与芽孢杆菌(Bacillus)的同源性达到99.8%。综合以上鉴定结果确定G21菌株为芽孢杆菌。     

一株弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定导致罗非鱼患病的原因，本试验对濒临死亡的罗非鱼进行无菌解剖，从心脏部位分离得到1株细菌，通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA分析，确定菌株为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）。药敏试验结果显示，该菌株具有很强的多重耐药性，测试的20种药物中，该菌株对恩诺沙星、青霉素等13种药物具有完全耐药性，仅对头孢曲松、头孢他啶、头孢拉定、哌拉西林、舒巴坦5种药物敏感。人工感染试验结果显示，该菌对草鱼、黄颡鱼、罗非鱼、禾花鲤具有较强的致病性。本试验结果阐明了罗非鱼患病的原因，同时在养殖过程中可指导养殖户合理用药。     

1株产碱性木聚糖酶的芽胞杆菌的分离鉴定及其相关研究

分离到1株产碱性木聚糖酶的革兰氏阳性菌株,通过菌落形态及16srDNA序列同源性分析,确定该菌株为短小芽孢杆菌。生长条件和产酶条件研究结果显示,最适温度和pH分别为50℃和pH8·0。培养基优化试验显示在有机和无机混合氮源条件下(NH4NO30·57%;牛肉膏1%;蛋白胨0·5%;酵母提取物0·5%;木聚糖0·5%)木聚糖酶产量达到最高(180U/mL)。酶学试验表明最适反应条件为50℃,pH8~9;在pH9的条件下,孵育120min时仍具有75%的活力,表明该酶具有较强的碱耐受性。     

1株奶牛源约翰逊不动杆菌的分离鉴定

旨在了解从奶牛垫料中分离得到1株革兰阴性菌的病原特征,本研究通过形态学观察、生化试验、染色镜检、16S rDNA同源性分析等方法对分离菌进行鉴定,并采用药敏试验测定药物敏感性,小鼠攻毒试验确定分离菌株毒力情况.结果 表明,分离菌为革兰阴性菌;扩增的16S rDNA序列长度为1283 bp,与约翰逊不动杆菌的核苷酸相似性...     

1株奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为确定奶牛垫料中是否含有病原菌并深入了解垫料中优势生长菌的类型、耐药性及致病性等情况,本试验进行了细菌分离培养、革兰染色镜检、生化试验鉴定、16S rDNA序列分析及同源性比对、药敏试验、小鼠致病性试验。结果显示,分离菌在普通营养琼脂平板上形成圆形、表面光滑的白色菌落,血琼脂平板上形成黏稠、较大的白色菌落。革兰染色镜检结果显示,分离菌为革兰阳性,球型,呈葡萄串状排列,或单个散落。生化试验结果显示,分离菌对木糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、硝酸盐还原等呈阳性反应,而蜜二糖、木糖醇、山梨醇、尿素、V-P反应等呈阴性反应。16S rDNA序列分析结果显示,扩增的16S rDNA序列长度为1 298 bp,与松鼠葡萄球菌的核苷酸同源性达99.85%~100%;系统进化树结果显示,分离菌与松鼠葡萄球菌处于同一分支。动物试验结果表明,分离菌株对试验小鼠有较强的致病性,以0.2 mL/只（7.9×10⁸ CFU/mL）菌液的剂量接种小鼠,在48 h内死亡率为60%（3/5）。药敏特性分析结果显示,分离菌株对复方新诺明、氨苄西林等7种药物敏感,对克林霉素、头孢噻肟和头孢呋辛中度敏感,对青霉素、红霉素和林可霉素耐药。本研究为奶牛源松鼠葡萄球菌的分离鉴定及防控提供了参考依据。     

产类胡萝卜素酵母菌的鉴定及其发酵醋糟营养价值的研究

本研究旨在对实验室前期分离的酵母菌进行鉴定,并利用其发酵醋糟,以提高醋糟饲用营养价值。利用形态学特征、生理生化特性及26S rDNA的D1/D2区核酸序列分析,鉴定了1株产类胡萝卜素的酵母菌,并对醋糟进行固态发酵。结果表明:被鉴定菌株符合红酵母的形态学特征及生理生化特性,其26S rDNA的D1/D2区核酸序列与黏性红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)相关序列相似度达100%,故该菌株被鉴定为黏性红酵母;与未发酵醋糟相比,该菌株发酵醋糟的干物质、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量变化均不显著,粗脂肪和总糖含量均降低(P<0.01),粗蛋白质与真蛋白质含量均升高(P<0.01),尤其是产生了6.60 mg/kg具有多种生物学功能的类胡萝卜素。结果显示,该株产类胡萝卜素的酵母菌为黏性红酵母,该菌发酵可改善醋糟的营养价值。     

产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定和发酵特性的初步研究

通过酪蛋白平板初筛,以羽毛为唯一的碳源与氮源复筛,筛选出一株新型的高产角蛋白酶的菌株S6,根据其形态观测结果和生理生化指标的测定结果,初步鉴定其属于地衣芽孢杆菌属。以羽毛为底物对地衣芽孢杆菌S6的发酵特性初步研究发现,在72 h,地衣芽孢杆菌S6酶活性、可溶性蛋白量达到最大,分别为186.8 U/mL,160.87 μg/mL,表明在降解羽毛的过程中,其具有很好的开发前景。     

几株桑天牛成虫肠道优势细菌的分离与鉴定

为了研究桑天牛成虫肠道微生态环境,探索破坏桑天牛营养利用等功能的生物防治新途径,对健康桑天牛成虫肠道的优势细菌进行分离鉴定。选择平皿上出现3个以上的菌落作为肠道优势细菌进行分离纯化,共获得6个菌株。6个菌株均呈杆状,革兰染色和氧化酶反应均呈阴性,在25～35℃、pH 5.5～9.5的环境中生长良好,但各菌株的菌落形态及多种生化性状有差异。通过菌体形态观察、染色反应、生理生化特征分析及16S rDNA碱基序列测定与同源性分析,鉴定1、2、3号菌株分别为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),4、5、6号菌株分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)。     

羊瘤胃乳酸菌的分离鉴定及抗逆性筛选

为开发羊源乳酸菌菌种资源,从健康成年散养山羊瘤胃内容物中分离乳酸菌,经生化试验、基因测序以及同源性分析、构建遗传进化树等方法对分离出的乳酸菌进行鉴定,并通过耐酸和耐胆盐试验筛选抗逆性良好的乳酸菌.结果表明:从散养山羊瘤胃内容物中分离出11株乳酸菌,将其编号为R1～R9、R11和R12;其中R1、R2为杜氏肠球菌,R3、...