雷公藤总生物碱对粘虫中肠细胞超微结构及消化酶活性的影响

采用电子显微镜技术与生化分析研究了雷公藤总生物碱对粘虫幼虫中肠组织及主要消化酶的影响.电镜观察结果表明,中毒试虫的中肠细胞及其细胞器发生明显病变,肠壁细胞微绒毛零乱、脱落;线粒体肿胀.出现空白亮区.双层膜不完整;内质网池扩张,囊泡化,粗面内质网减少.消化酶活性测定结果表明,中毒试虫中肠蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性和正常试虫相比无明显变化.     

苦皮藤素Ⅳ对粘虫中肠组织影响的超微结构观察

采用电子显微镜技术研究了苦皮藤素 对粘虫(Mythimnaseparata(Walker))中肠组织的影响。电镜观察结果表明,苦皮藤素 对粘虫中肠肠壁细胞的质膜和内膜系统有一定影响。在苦皮藤素 作用下,试虫的柱状细胞顶膜微绒毛扩张;线粒体肿胀;粗面内质网扩张,囊泡化;杯状细胞与柱状细胞之间间隙增大。这表明苦皮藤素 破坏了中肠细胞的结构,使中肠肠壁细胞损伤及细胞间隙增大,导致毒物易于穿过肠壁细胞间隙进入血淋巴,进而到达作用部位。     

诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响

[目的]雷公藤甲素是雷公藤主要药用活性成分之一,具有抗肿瘤、免疫抑制和抗炎等多种作用.应用植物细胞培养技术生产雷公藤甲素具有重要意义,而诱导子是提高植物细胞培养中次生代谢产物积累的有效途径之一.研究通过探究非生物和生物诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响,以期提高雷公藤甲素产量,为雷公藤悬浮细胞规模化生产雷公藤甲素等药用活性物质提供基础.[方法]以水杨酸(SA)、LaCl3以及雷公藤内生真菌NS-5、NS-17作为诱导子,研究不同类型及不同浓度诱导子添加对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累及细胞活力、细胞生长、总糖消耗、PAL活性的影响.[结果]SA、LaCl3和内生真菌NS-5、NS-17诱导子均可促进雷公藤悬浮细胞培养物中雷公藤甲素的积累.非生物诱导子的效应大小受其浓度的影响,0.1 mg/L的SA诱导作用最好,可提高细胞活力,促进细胞生长,总糖消耗增加,升高PAL活性,雷公藤甲素产量最高是对照的3.5倍.随着浓度的降低,LaCl3对雷公藤甲素的诱导作用增强,20 mg/L LaCl3诱导下的最高含量是对照的2.0倍,同时20 mg/L LaCl3也提高了PAL活性和总糖消耗,但对细胞活力和细胞生长影响不大.内生真菌诱导子的效应大小即与诱导子种类和添加时间有关.细胞培养第4天添加NS-5、NS-17菌丝体提取物,第8天添加任一内生真菌诱导子均提高了雷公藤甲素的积累,其中NS-5菌丝体提取物的诱导效果相对最强,细胞培养第8天添加时雷公藤甲素产量最高,是对照的2.4倍,但雷公藤甲素的积累与细胞生长及PAL活性无明显的关联.[结论]诱导子的添加能够提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素的积累,诱导效应的大小与诱导子种类、添加浓度及添加时间有关.本研究中的0.1 mg/L SA、20 mg/L LaCl3及内生真菌NS-5菌丝体提取物显示了良好的诱导效果,在利用细胞培养技术进行雷公藤甲素生产中具有较好的应用前景.     

雷公藤甲素对哮喘小鼠白介素13和嗜酸性粒细胞趋化因子表达的影响

目的观察雷公藤甲素(TL)对哮喘小鼠肺组织中白介素13(IL-13)和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)表达的影响,探讨TL治疗哮喘的作用机理。方法40只雄性昆明小鼠随机分成4组:正常对照组、哮喘未治疗组、地塞米松治疗组及TL治疗组,以卵清蛋白致敏和激发方法建立哮喘小鼠动物模型并给予相应治疗。24 d后处死小鼠,检测各组支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸性粒细胞(Eos)计数;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组小鼠肺组织匀浆中IL-13、eotaxin mRNA的表达量;采用免疫组化法检测各组小鼠肺组织切片中IL-13、eotaxin蛋白的表达水平;并探讨他们之间的关系。结果哮喘未治疗组小鼠肺组织IL-13、eotaxin mRNA及蛋白的表达量均明显高于正常对照组(P<0.01),TL治疗组及地塞米松治疗组低于哮喘未治疗组(P<0.01或<0.05)。肺组织IL-13蛋白的表达与BALF中的白细胞总数、Eos计数及肺组织eotaxin蛋白的表达呈正相关(r分别为0.513、0.604、0.625,P<0.01)。肺组织eotaxin蛋白的表达与BALF中的白细胞总数、Eos计数呈正相关(r分别为0.679、0.718,P<0.01)。结论TL抑制哮喘气道炎症的机制可能与其抑制肺组织中IL-13及eotaxin的表达有关。     

雷公藤内生真菌对Fusarium nisikadoi NS-1雷公藤甲素合成的影响

为了解雷公藤内生真菌的雷公藤甲素合成能力以及内生真菌间互作对雷公藤甲素合成的影响,本试验从雷公藤中筛选出1株产雷公藤甲素的内生真菌NS-1,鉴定为Fusarium nisikadoi;通过NS-1与其它内生真菌共培养,发现青霉菌属(Penicilliumn)内生真菌NS-8能够显著促进NS-1的雷公藤甲素合成(P<0.05),是对照的1.6倍.以此为基础,通过制备和添加NS-8菌丝体提取物和发酵液诱导子,进一步研究内生真菌NS-8诱导子对NS-1雷公藤甲素合成的影响.结果表明,NS-8发酵液诱导子促进了NS-1的糖消耗速率,提高了NS-1生物量和培养液pH值,明显促进了NS-1胞外雷公藤甲素的积累,最高含量是对照的4.2倍;NS-8菌丝体提取物诱导子对培养液pH值的影响不显著,NS-1糖消耗速率略有下降,对NS-1生长有一定的抑制作用,胞外雷公藤甲素含量低于对照.两种诱导子对NS-1胞内雷公藤甲素合成均未呈现明显的促进作用.因此,NS-8主要通过其代谢产物强化NS-1雷公藤甲素的合成.     

雷公藤甲素提取方法研究

以雷公藤叶为原料,采用浸提法提取雷公藤甲素.选择不同提取溶剂、提取时间、提取次数和料液比进行提取,以高效液相色谱法测定提取物中雷公藤甲素含量,采用梯度试验、对比试验、数量统计,得到最佳浸提参数为:提取溶剂为70%甲醇,提取时间6 h,提取3次,提取料液比为1:6(w/v).     

雷公藤愈伤细胞悬浮培养生产雷公藤甲素的研究

对雷公藤叶愈伤组织进行悬浮培养,研究不同营养条件对雷公藤愈伤细胞生长及其雷公藤甲素质量分数的影响.结果表明：悬浮细胞在White培养基上增殖最快,而在MS培养基上生长最慢;White和MS培养基中悬浮细胞在第6天时雷公藤甲素质量分数最高,分别为7.14 mg/g和4.77 mg/g,而N6培养基中雷公藤甲素最大产量为6.34 mg/g,出现在第9天;3组细胞培养悬浮液中的雷公藤甲素峰值产量分布规律为White（28.13μg/mL）〉N6（21.27μg/mL）〉MS（16.27μg/mL）,同时培养基的pH随细胞的生长有波动现象.     

反相高效液相梯度洗脱法测定药材中雷公藤甲素的含量

[目的]通过高效液相色谱法建立测定雷公藤甲素含量的方法,控制药材质量,为保证临床用药的有效性和安全性提供依据。[方法]采用反相高效液相层析（RP-HPLC）梯度洗脱法建立雷公藤药材中雷公藤甲素的定量方法。采用AgilentC18柱（2.1mm×150mm,3μm）;乙腈-水二元梯度洗脱,0～8min（10：90～25：75,V：V）,8～33min（25：75～35：65,V：V）,33～40min（35：65～95：5,V：V）,40～48min（95：5,V：V）,48～55min（10：90,V：V）;流速：1.0ml/min;检测波长：220nm。[结果]采用RP-HPLC梯度洗脱法不仅快速有效地实现了药材中雷公藤甲素的良好分离,而且能够有效防止分析过程中的拖尾现象,较准确地测定雷公藤甲素的含量。雷公藤甲素的线性范围为25～2000μg/ml（r=0.9999）,该方法回收率为97.48%（RSD=1.55%）。[结论]该方法灵敏度高,准确可靠,重现性好,结果稳定。     

HPLC法测定昆明山海棠蜜中雷公藤甲素的含量

 昆明山海棠蜜经萃取洗脱后，采用反相C¹⁸柱，以乙腈-水（30∶70）为流动相，以218 nm为检测波长，检测昆明山海棠蜜中雷公藤甲素的含量。结果：雷公藤甲素在1～20 μg/g范围内线性良好，r为0.999 9，平均回收率为103.06%（n=5），RSD为1.71%。     

杠柳新苷P和E对粘虫和小地老虎中肠3种解毒酶的影响

为进一步探讨杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制。比较研究高活性杠柳新苷P(Periploca sepium P,PSP)和无杀虫活性的杠柳新苷E(Periploca sepium E,PSE)对6龄粘虫幼虫(Mythimna separata)与小地老虎幼虫(Agrotis ypsilon)中肠3种代谢酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞色素P450-O-脱甲基酶]活性的影响。结果表明:药后8h,PSP和PSE使粘虫幼虫GST活性增加,但PSP上升趋势比PSE更高。而2种化合物对试虫CarE活性均无明显影响。药后12h,PSP和PSE使粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力显著下降,而小地老虎中该酶活性无明显变化。因此,可推测GST可能参与昆虫对杠柳毒素的解毒作用,而细胞色素P450-O-脱甲基酶活性被杠柳毒素抑制可能是造成粘虫中毒的机制之一。     

松油烯-4-醇对粘虫酯酶活性及同工酶的影响

以粘虫为试虫,测定了松油烯-4-醇对其酯酶活力和酯酶同工酶的影响。结果表明,松油烯-4-醇对粘虫血淋巴酯酶有一定的激活作用,在兴奋期、痉挛期、麻痹期和复苏期,酯酶活性分别为对照的1．03、1．07、1．43和1．16倍;试虫同工酶的变化与酯酶活力变化基本吻合,即酶活力增强时,同工酶的主酶带增强或新增一些酶带;酶活力变弱时,同工酶的主酶带减弱或一些弱带完全消失。     

杠柳新苷Ｔ作用东方粘虫幼虫中肠细胞的免疫定位研究

【目的】明确杠柳新苷T作用后在东方粘虫幼虫中肠肠壁细胞中的分布,探讨其杀虫作用机制。【方法】鉴于杠柳新苷T对东方粘虫幼虫具有明显的胃毒活性,而对小地老虎幼虫无杀虫活性,采用胶体金免疫电镜技术,比较观察了杠柳新苷T处理的东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫中肠肠壁细胞的变化。【结果】东方粘虫幼虫经杠柳新苷T处理后,胶体金颗粒首先出现在微绒毛上,且密度随着处理时间延长而逐渐增大,最终破坏微绒毛;同时,胶体金颗粒在细胞内的细胞器膜上也有出现,并损伤细胞器。小地老虎幼虫经杠柳新苷T处理后,中肠肠壁细胞及细胞器均没有明显变化,其上也没有发现胶体金颗粒的存在。【结论】杠柳新苷T对东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫的选择性与其在2种试虫中肠肠壁细胞上的特异性结合存在显著差异有关,杠柳新苷T作用东方粘虫幼虫后的初始结合部位可能是其中肠肠壁细胞,推测杠柳新苷T的靶蛋白可能存在于中肠肠壁细胞膜及细胞器膜上。     

粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的克隆及其功能分析

【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。     

鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素对粘虫生物活性初步研究

采用小叶碟添加法测定了鬼臼毒素 ( Podophyllotoxin)和脱氧鬼臼毒素 ( Deoxypodophyllotoxin)对粘虫 ( Mythimna separata W.)的生物活性。结果表明 ,二者对粘虫 4龄幼虫均有很强的拒食作用 ,2 4h、48h和72 h的 AFC50 值分别为 1 .40 86、1 2 .45 1 4、0 .8881 mg/m L和 0 .4686、1 .1 0 66、0 .2 5 99mg/m L;二者对粘虫的生长发育抑制作用也较强 ,致使粘虫生长发育各历期均延迟 ,化蛹率、羽化率、产卵量等均明显降低     

粘虫肠道细菌群落多样性的PCR DGGE指纹图谱分析

研究东方粘虫[ Myth imna se parata (Walker)]肠道细菌的多样性.采用常规分离培养与分子鉴定相结合的方法,并以16S rDNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(DGGE)对肠道细菌进一步分离,DGGE分离样品是研磨提取粘虫中肠组织DNA、提取培养混合菌DNA及直接以培养混合菌为模板进行PCR扩增的产物.结果表明,共得到DGGE条带19条,其中肠组织研磨提取DNA的DGGE条带最多,为17条;直接以培养混合菌液为模板进行PCR扩增次之,为13条;培养混合菌液提取DNA的条带最少,为12条.传统方法和分子生物学方法相结合研究肠道微生物多样性时能获得更全面的微生物信息,可采用培养混合菌提取DNA再结合其他方法进行后续研究.     

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。     

5种杀虫剂对粘虫不同发育阶段的室内毒力

采用胃毒法、卵和蛹采用浸渍法,测定甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯虫苯甲酰胺、辛硫磷、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯5种杀虫剂对粘虫卵、1龄幼虫、3龄幼虫、5龄幼虫和蛹的室内毒杀作用。结果表明:供试5种杀虫剂对卵的触杀作用依次为甲氨基阿维菌素苯甲酸盐高效氯氟氰菊酯联苯菊酯辛硫磷氯虫苯甲酰胺;对幼虫的毒杀作用依次为甲氨基阿维菌素苯甲酸盐联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯氯虫苯甲酰胺辛硫磷;对蛹的触杀作用依次为高效氯氟氰菊酯联苯菊酯辛硫磷甲氨基阿维菌素苯甲酸盐氯虫苯甲酰胺。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对粘虫卵和幼虫的毒杀效果最好,对卵、1龄幼虫、3龄幼虫、5龄幼虫的LC50分别为0.276、1.555、0.109和1.483 mg/L;高效氯氟氰菊酯对粘虫蛹的触杀效果最好,LC50为5.539mg/L。建议根据粘虫发生的实际情况,在生产中将甲维盐和高效氯氟氰菊酯作为防治粘虫的首选药剂。与其他供试的4种杀虫剂相比,氯虫苯甲酰胺对粘虫卵和蛹的毒杀作用最弱,对1龄、3龄、5龄幼虫的毒杀作用略高于辛硫磷或与其相当,显著低于联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐,建议在粘虫大发生时慎用。     

饥饿胁迫对粘虫幼虫糖原、海藻糖含量和蜕皮激素滴度变化的影响

为探究饥饿胁迫对粘虫Mythimna separata (Walker)代谢活动的影响，选用其4~6龄幼虫进行饥饿处理（1 d，2 d，3 d），分别测定饥饿及正常取食的粘虫幼虫糖原、海藻糖含量和蜕皮激素［20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)］滴度的变化情况。结果表明：与对照组相比，饥饿组随处理天数的增加，其糖原含量逐渐降低，4~6龄饥饿第3天时分别为15.11 mg/g、16.13 mg/g和15.50 mg/g，均与对照组差异显著；海藻糖的含量则逐渐升高，各龄期饥饿第3天时分别达到35.41 mg/mL、39.56 mg/mL和40.06 mg/mL，其中第2天和第3天的含量均显著高于对照组；4龄对照组的20E滴度先升高后降低，且在试验过程中发现有部分幼虫在第3天蜕皮进入5龄，而饥饿组第3天的20E滴度为39.92 ng/L，较对照组的最大值49.71 ng/L低9.79 ng/L且差异显著，但饥饿组在处理第3天时却未发现蜕皮；5龄饥饿第2天和第3天的20E滴度均显著低于对照组，说明幼虫在饥饿胁迫下生长发育减缓，但6龄饥饿组的20E滴度均显著高于对照组，说明该阶段20E急剧增加，使末龄幼虫加快发育以便提前进入蛹期，各龄期饥饿3 d时其20E滴度分别为39.92 ng/L、45.36 ng/L和48.03 ng/L。可以看出，糖原、海藻糖和蜕皮激素均参与粘虫幼虫对饥饿胁迫的适应，这为进一步揭示饥饿肋迫下粘虫幼虫体内关键因子的调控机制以及繁殖适应性奠定基础。     

东方粘虫U6启动子的克隆及功能验证

为了持续获得大量短片段干扰RNA(short interference RNA,siRNA),通过染色体步移技术克隆得到东方粘虫U6snRNA基因5′-端侧翼启动子序列1 426bp。经生物信息学分析,该序列含SPH元件、八聚体序列(OCT)、远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)及TATA box等RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ,RNA PolⅢ)U6启动子的特征元件。通过构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体的方式,对增强型绿色荧光蛋白EGFP基因进行RNAi,证明克隆得到的东方粘虫U6启动子可成功驱动shEGFP表达,具有U6启动子功能。为后续构建以东方粘虫V-ATP酶H亚基为靶基因的沉默载体奠定基础。     

Effects of Terpinen-4-ol on Four Metabolic Enzymes and Polyphenol Oxidase （PPO） in Mythimna separta Walker

To study insecticidal mechanism of terpinen-4-ol, a main insecticidal composition in the essential oil of Sabina vulgaris, the 5th instar larvae of Mythimna separta, were investigated with terpinen-4-ol by topical application. The activities of phosphatase, glutathione S-transferase （GSTs）, cytochrome P450 （P450）, and polyphenol oxidase （PPO） of tested insects were determined in all poisoning stages, including exciting stage, convulsing stage, paralysis stage, and recover stage. The result showed that the activities of both acid phosphatase （ACP） and alkaline phosphatase （AKP） in treated insects were induced by terpinen-4-ol, but ACP was inhibited in paralysis stage. The activities of GSTs were inhibited in exciting stage, convulsing stage, and paralysis stage, but gradually recovered in recover stage. O-demethylase activity of cytochrome P450 was inhibited by terpinen-4-ol, and the inhibition rate in all poisoning stages were 26.27, 46.03, 80.24, and 90.22%, respectively. PPO activities were strongly inhibited by terpinen-4-ol both in vitro and in vivo. In conclusion, the activities of P450, GSTs, and PPO could have relation with toxicity of terpinen-4-ol against larvae of the Mythimna separta, but recover stage of the poisoning insects might be related to GSTs induced. As a new insecticide or synergist, terpinen- 4-ol has a potential value in field of insecticide resistance management.