重庆市羊附红细胞体感染情况研究

参考GenBank登录的羊附红细胞体16S rRNA序列设计引物,建立检测羊附红细胞体16S rRNA的特异性PCR方法,对重庆市14个区县山羊进行附红细胞体感染的分子流行病学调查.结果表明:重庆市附山羊红细胞体感染率为16.1%;其中1周岁以下羊附红细胞体感染率为13.9%,低于1周岁以上羊附红细胞体感染率(17.0%).重庆黑山羊、波尔山羊、南江黄羊和板角山羊的附红细胞体感染率分别为15.9%,16.3%,16.6%和17.6%.     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立

据猪附红细胞体重庆株16S rRNA基因的序列特点设计合成种特异性引物,建立了猪附红细胞体PCR诊断方法.该方法能特异性扩增840 bp的猪附红细胞体16S rRNA基因片段,而对牛温氏附红细胞体、羊附红细胞体、猫血巴尔通氏体CA株、绵羊肺炎支原体、猪肺炎支原体、假单孢茵、大肠杆茵、沙门氏茵、肝片吸虫、葡萄球菌等的基因组DNA没有扩增条带出现.对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为0.16 fg.通过对30份临床样品的检测,21份猪附红细胞体感染为阳性,其余为阴性.结果表明:建立的PCR诊断方法具有很高的敏感性和特异性,可用于猪附红细胞体的临床诊断和流行病学调查.     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和序列分析

为分析吉林省流行的猪附红细胞体基因序列,根据发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计引物,扩增出长度约为541 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pGEM-T Easy载体.将经Not Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与发表的附红细胞体基因序列进行比较,试验所获得的核苷酸序列与猪附红细胞体16S rRNA基因序列非常相近,同源性为97.8%～100%,从而证明吉林省所流行的猪附红细胞体属于16S rRNA基因群.     

羊附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据羊附红细胞体16S rRNA基因序列设计特异性引物,建立了羊附红细胞体的PCR诊断方法.该方法能扩增羊附红细胞体16S rRNA基因片段,对大肠杆菌、羊无形体、羊源支原体、猪附红体和假单孢菌基因组DNA没有扩增出条带,所能检测羊附红细胞体DNA的最低量为1.82 pg/mL.运用所建立的方法对从重庆市荣昌县采集的110份羊血样进行附红细胞体检测,其中13份羊附红体感染阳性,表明该方法特异性和灵敏度高,可用于急性羊附红细胞体病和临床带菌羊的检测.     

东北三省部分地区猪附红细胞体16S rRNA核苷酸序列比较分析

为了解东北三省猪附红细胞体基因的流行变异情况,本试验选取相对保守的16S rRNA核苷酸序列作为分析对象,采用酚仿抽提法提取吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体基因组DNA,用一对特异性引物扩增目的DNA,然后分别与pMD-18T载体连接并转化BL-21菌株,经重组质粒PCR鉴定后并测序,比较其核苷酸序列。从同源性分析结果可以看出,黑龙江株、辽宁株与广东株猪附红细胞体核苷酸同源性最高,均达到100%;吉林株与美国株猪附红细胞体的核苷酸同源性最高,为97%。系统进化分析结果显示,黑龙江株与辽宁株猪附红细胞体亲缘关系最近,而与吉林株猪附红细胞体较远。结果表明,吉林株、辽宁株和黑龙江株猪附红细胞体16S rRNA基因序列存在差异。     

羊附红细胞体巢式PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种更加准确、敏感的羊附红细胞体检测方法,根据Gen Bank上发表的羊附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号:AF338268),设计内、外2对特异性引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性、重复性试验及临床样本检测。结果表明,该方法能扩增出大小为506 bp的羊附红细胞体特异性片段,与Gen Bank收录的相关参考序列同源性为97.8%~99.6%;与猪附红细胞体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为0.654 fg·μL~(-1);具有良好的重复性;对77份羊临床血液样品检测结果表明,羊附红细胞体感染率为71.43%,高于常规PCR和已报道的巢式PCR检测结果。     

羊附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据羊附红细胞体16S rRNA基因序列设计特异性引物,建立了羊附红细胞体的PCR诊断方法.该方法能扩增羊附红细胞体16S rRNA基因片段,对大肠杆菌、羊无形体、羊源支原体、猪附红体和假单孢菌基因组DNA没有扩增出条带,所能检测羊附红细胞体DNA的最低量为1.82 pg/mL.运用所建立的方法对从重庆市荣昌县采集的110份羊血样进行附红细胞体检测,其中13份羊附红体感染阳性,表明该方法特异性和灵敏度高,可用于急性羊附红细胞体病和临床带菌羊的检测.

Abstract：

Based on the sequence data of 16S rRNA gene of Eperythrozoon ovis,a set of E.ovis specific primers were designed.No PCR products were amplified from purified DNA of Escherichia coli,Anaplasma ovis,Mycoplasma ovis,Eperythrozoon suis and Pseudomonas putid.It was estimated that as few as1.82 pg/mL E.ovis genomic DNA was detectable by PCR.Using this method,110 blood samples from Rongchang were successfully detected and 13 samples were positive with E.ovis infection.The results showed the PCR method developed was an effective tool for diagnosing E.ovis infection in sheep with high sensitivity and specificity.It will be useful for detecting the acute eperythrozoonosis and latent infected carrier animals.     

肉牛附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一个能快速准确的检测出肉牛附红细胞体的分子生物学诊断方法,及时监控好人畜共患病。试验根据Genbank中发表的肉牛附红细胞体16SrRNA序列设计一对特异性引物,通过PCR方法,对肉牛附红细胞体基因组DNA进行扩增。结果表明:扩增出了一段412 bp的DNA片段,与Genbank中发表的肉牛附红细胞体序列同源性为98%。将建立的PCR方法对大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行检测为阴性,检测肉牛附红细胞体DNA的最低浓度为1.23 ng/μL。该方法快速、准确、特异性好、灵敏度高,为肉牛附红细胞体病的临床诊断提供了新的方法。     

附红细胞体病的病原学及诊断学研究进展

附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是近年来才逐渐被医学界和兽医界重视的一种人畜共患病，其病原——附红细胞体(Eperythrozoon)是一类无细胞壁、嗜血液寄生的多形态微生物，目前仍被列为立克次氏体目(Rickettisiaies)、无形体科(Anoplasmataceae)、附红细胞体属(Eperythrozoon)。近几年随着对数种附红细胞体的基因序列(16S rRNA)的分析，认为附红细胞体不应属于立克次氏体，宜将其列入柔膜体纲(Mocullicute)的霉形体属(Mycoplasma)。因此，就附红细胞体病的病原分类、形态及生物学特征，以及该病的诊断方法等研究进展作其阐述。     

猪附红细胞体快速诊断方法的研究

根据GenBank上已报道的猪附红细胞体16S rRNA的序列设计一对特异性引物,进行PCR扩增并将产物克隆到T-vector后测序.结果表明扩增到的目的基因片段为404 bp,与GenBank上Mycoplasma suis序列同源性为97%.试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康猪血液、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、弓形虫、猪圆环病毒DNA无交叉反应,能检测出的最低DNA浓度是8.6 fg·μL-1.该方法具有快速、准确、敏感等特点,为浙江地区猪附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段.     

不同药物对温氏附红细胞体体外杀灭效果研究

[目的]筛选对温氏附红细胞体体外杀灭具有最佳效果的药物。[方法]以RPMI-1640为基础培养液,加入30%犊牛血清,选用盐酸土霉素、恩诺沙星、磺胺对甲氧嘧啶、硫酸庆大霉素、磷酸伯氨喹啉、盐酸咪唑苯脲、贝尼尔7种药物,在37℃、5%CO2的环境下,进行温氏附红细胞体体外药物杀灭试验。[结果]磷酸伯氨喹、盐酸咪唑苯脲对牛附红细胞体的体外杀灭效果最佳,当培养液药物浓度为2 000μg/ml,药物与附红细胞体作用6 h时,红细胞染虫率显著下降到30%以下。盐酸土霉素、恩诺沙星、贝尼尔和磺胺对甲氧嘧啶对附红细胞体均有一定作用。硫酸庆大霉素具有较强抗菌作用,但对牛附红细胞体病无效。[结论]该研究为临床选择抗附红细胞体病的合适药物提供理论依据。     

致猪水肿病大肠杆菌鄂E株SLT-IIeB基因的克隆、序列分析及原核表达

以湖北本地分离的致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,PCR扩增去掉信号肽和跨膜区的SLT-IIeB基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG。同时对筛选出的阳性质粒pGEX-SLT-IIeB进行测序,测序结果与Genbank上发表的12个SLT-IIeB基因序列的同源性达100%,表明该基因保守性很好。重组质粒pGEX-SLT-IIeB经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE分析表明表达产物GST-SLT-IIeB有特异性表达带,Western-blot检测证实表达产物具有免疫反应性。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

湖北省油菜施硼效果及土壤有效硼临界值研究

【目的】从区域角度研究湖北省油菜主产区硼肥施用对油菜（Brassica napus L.）生长及产量的效果,确定目前生产条件下土壤有效硼临界值,为油菜科学施肥提供依据。【方法】2005～2006年在湖北省布置30个田间试验研究油菜施硼产量效应,结合土壤有效硼含量确定缺硼临界值。【结果】施硼对油菜的营养生长及产量构成因素均有促进作用,30个试验点施硼平均增产油菜籽428 kg•ha-1,平均增产率19.2%,70%的试验增产效果显著,增产量超过500 kg•ha-1的试验点占26.7%;土壤有效硼含量与施硼效果呈极显著负相关;按照不施硼产量相对于施硼处理的90%作为判断标准,土壤有效硼临界值比20年前第二次土壤普查时确立的临界值有所提高。【结论】湖北省油菜施用硼肥增产效果显著,现阶段油菜种植的土壤有效硼临界值为0.58 mg•kg-1,大约80%的地块在种植油菜时需要施硼。     

应用K88-K99 PCR试剂盒检测大肠杆菌研究

用研制的K88一K99 PCR诊断试剂盒对湖北省和江苏省的5个猪场238个病猪粪便进行了检测。扩增结果是K88检出率92．0％(219／238)；K99检出率89．1％(212／238)；阳性对照检出率100％，阴性对照未扩增到目的DNA片段。结果表明，运用PCR试剂盒检测具有快速、特异的优点，可同时处理大量样品，且可直接对粪便样品进行检测，值得进一步推广。     

温氏附红细胞体对奶牛免疫水平的影响

选择5头感染温氏附红细胞体的奶牛和5头健康奶牛,分别进行红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率的测定。结果表明,感染温氏附红细胞体的奶牛其红细胞C3b受体花环率、免疫复合物花环率、B淋巴细胞EA花环率、外周血中T淋巴细胞百分率、淋巴细胞转化率明显低于健康奶牛,且二者在0.01水平上有差异。这说明温氏附红细胞体对奶牛的免疫水平有明显的抑制作用。     

仔猪水肿病高免血清的制备及初步应用

用自行研制的仔猪水肿病多价油乳剂灭活苗和蜂胶灭活菌苗,对猪进行了免疫,试制了猪水肿病高免血清,将试制的血清在湖北省内进行了试用,其对猪水肿病的治愈率达到92%,而单独使用亚硒酸钠的治愈率仅为25.0%,表明所制备的高免血清具有较高的治疗价值,可在生产中推广应用.     

基于生态位因子模型的湖北省松材线虫病风险评估

  目的   当前湖北省松材线虫Bursaphelenchus xylophilus疫情形势严峻。通过研究湖北省松材线虫病的入侵风险，分析松材线虫病在湖北省的危害程度，为当前疫情的防治工作提供建议和参考。   方法   结合“3S”技术，应用生态位因子模型(ENFA)，选取影响松材线虫定殖和传播的4类影响因素(气候、植被、地形、人类活动)，对松材线虫病在湖北的入侵风险进行了预测和评价。   结果   湖北省松材线虫病高风险区面积38 884.62 km2，占湖北省总面积的20.92%，高风险区主要集中于海拔较低、人类活动频繁的中部和东部地区，中风险区面积66 501.84 km2，占总面积的35.77%，低风险区面积80 513.54 km2，占总面积的43.31%，中低风险地区主要分布在林地稀少的江汉平原和西部的高海拔山地。松材线虫偏好分布在温度较高，降水丰富，海拔较低，离人类居住点较近且人类活动频繁的针叶林地区。通过交叉验证(cross-validation)对模型的预测进行检验，得到P/E曲线，曲线呈单调递增且Boyce指数很高，说明模型精度很高。   结论   ENFA模型能很好模拟松材线虫病的风险区域，模型结果可为湖北省各县市的松材线虫病防治决策提供参考。图2表3参25     

山东省禽源致病性大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物耐药基因的检测

为了解山东省禽源致病性大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物耐药基因分布情况,对2004～2011年间分离的230株禽源致病性大肠杆菌进行了qnrA、qnrB、qnrS基因的PCR检测,结果发现未检出qnrA和qnrB,qnrS基因的检出率为25.22%(58/230)。对部分检出的qnrS基因测序后发现假阳性率较高(8/24),为了提高检测的特异性,建立了检测qnrS基因的套式PCR,测序结果表明该方法检出准确率为100%,使用该方法检出230株细菌中qnrS基因的携带率为16.52%(38/230),表明含qnrS基因的耐药质粒在山东省禽源致病性大肠杆菌中分布较为广泛。     

一株J亚型禽白血病病毒的分离鉴定及其gp85基因的序列分析

为确定安徽巢湖某地方品种养鸡场的疑似禽白血病(avian leukosis,AL)的病原,以DF-1细胞从肿瘤组织中分离病毒,采用RT-PCR方法进行鉴定,并对其感染细胞上清进行透射电镜观察。同时对送检病鸡的心、肝、脾及腺胃等进行组织病理学观察,最后将扩增出的gp85基因与GenBank收录的其他ALV序列进行比对分析。结果表明:PCR扩增产物大小约为928 bp,经测序证实为ALV gp85基因,将该分离株命名为AHCH-2018株。透射电镜观察到具有囊膜的大小约100 nm的病毒粒子。组织病理学结果显示,病鸡的心、肝、脾及腺胃中有大量成灶淋巴细胞增殖。遗传进化分析结果表明,分离株的gp85基因与多株ALV J参考毒株核苷酸序列的同源性为94.1%~99.5%,且与GD1401J株的核苷酸同源性最高,达99.5%,与A、B、C、D、E亚群同源性为46.5%~49.7%。该分离株与J亚群原型毒株处于同一大分支。本研究为了解安徽土鸡种群中禽白血病的分子流行病学特点提供了一定的数据参考。