草地藏系绵羊生长激素释放激素基因部分cDNA的克隆及生物信息学分析

为了克隆草地藏系绵羊生长激素释放激素基因,采用Trizol法从草地藏系绵羊下丘脑组织中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为207 bp的促生长激素释放激素基因(GHRH)的部分cDNA序列。结果表明获得的草地藏系绵羊GHRH部分cDNA序列与Gen Bank中注册的绵羊GHRH基因编码起始位置(86位)到292位区域高度同源,仅有1个碱基的差异,该cDNA序列编码69个氨基酸残基,其内含有信号肽序列,该氨基酸序列的31~57位具有典型胰高血糖素类似激素特征的GLUCA结构域。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究(英文)

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1177bp,开放阅读框长1050bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

GnRH在广西摩拉杂交水牛乳腺中的免疫组化定位及其受体基因表达的研究

采用免疫组化及RT-PCR技术检测广西摩拉杂交水牛乳腺组织中的促性腺激素释放激素(GnRH)及其受体.结果表明,15份正常乳腺组织中有13份呈GnRH免疫阳性反应,免疫阳性产物主要集中在腺泡细胞的胞质和胞膜,胞核无特异性染色;同时扩增的目的条带大小为1 008bp,与促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因片段大小一致.     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

建鲤催乳素基因全长cDNA的克隆及序列分析和组织表达

为了解催乳素(prolactin,PRL)的基因序列以及在建鲤渗透调节组织中的表达情况,采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)的方法分离克隆了建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian) PRL基因全长cDNA,得到1 028 bp的全长cDNA,包括633 bp的开放阅读框(ORF),51 bp 的5′末端非编码区(UTR)以及344 bp的3′末端非编码区(UTR)。对该基因序列和推测的氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：建鲤与其它硬骨鱼类该基因的氨基酸序列相似度为55.02%~94.76%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)相似度最高(94.76%),与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、斑马鱼(Danio rerio)相似度稍低,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度较低(55.02%),表明不同物种间PRL的氨基酸序列具有较高的保守性。用实时定量PCR (RT PCR)检测该基因在建鲤脑垂体、脑、肠、鳃、性腺、肝、脾、肾中PRL的相对表达量,其中脑垂体最高,其次是肝、鳃、脾、脑、肠、肾,在性腺中也有较低的表达量,表明脑垂体是建鲤PRL基因的主要表达场所,在性腺、肝、脾的表达说明其在鱼体内除了渗透调控可能还存在多种生理功能。     

促性腺激素释放激素(GnRHs)及其Ⅰ型受体在哺乳动物中的研究进展

促性腺激素释放激素(GnRHs)是调节动物繁殖的关键激素,在哺乳动物中主要以2种形式存在.GnRHⅠ调节促性腺激素,GnRHⅡ则具有神经调节和促进性行为作用.GnRHs可通过自/旁分泌在生殖组织和肿瘤中发挥作用.但GnRH Ⅰ和GnRHⅡ似乎仍有信号的差异,通过Ⅰ型受体而产生不同的下游效应.配体受体的相互作用和受体构象变化参与受体激活原理已被部分确定.这些研究结果为选择新的促性腺激素释放激素类似物提供潜在的更广泛和更具体的应用前景.另外,通过合成新的促性腺激素释放激素类似物,可在生产中发挥更广泛和更具体的应用.     

黄鳝Ⅲ型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析

以黄鳝为材料,提取肝脏总RNA,经RT-PCR扩增出Hepcidin基因cDNA的开放阅读框(ORF)及3′端非编码区序列(GenBank序列号FJ436807),序列分析表明,黄鳝Hepcidin含有一个273 bp的ORF,编码90个氨基酸残基,有信号肽(24个残基)、前体肽(40个残基)和成熟肽(26个残基)。在前肽部分具有前肽转化酶典型的RX(K/R)R基元。同源性比对表明,黄鳝Hepcidin与其他鱼类的同源性在40%以上,是Hepcidin抗菌肽家族的新成员。     

广西沼泽型水牛垂体中促性腺激素释放激素的免疫组化定位及其受体基因表达

[目的]探讨广西沼泽型水牛垂体中促性腺激素释放激素（GnRH）的细胞定位以及是否存在促性腺激素释放激素受体（GnRH—R）。为GnRH-R的克隆及其序列分析提供理论依据。[方法]采用免疫组织化学ABC法,确定促性腺激素释放激素在垂体中的定位,结合图像分析系统检测GnRH在垂体中的含量,并利用RT—PCR技术扩增其受体基因片段。[结果]腺垂体远侧部中呈现较强的阳性GnRH免疫反应,阳性物质主要分布在胞质,胞核呈阴性。神经垂体中无阳性信号。同时,在垂体中扩增出大小为1008bp的GnRH—R基因片段。[结论]腺垂体远侧部边缘区中有大量GnRH及其受体存在,证实垂体前叶是下丘脑-垂体-性腺轴以及多个内分泌轴相互作用的重要部位。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约386 bp的目的序列GnRH/GAP,先将其克隆到T载体上,通过酶切鉴定、序列测定分析,确认序列的正确性后,将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH/GAP,再转化到大肠杆菌TB1中,经IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的相对分子量约56 000的融合蛋白。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

Molecular Cloning and Characteristics Analysis of ghrelin Gene in Asian Swamp Eel(Monopterus albus)

Ghrelin is an important signaling molecule linking reproductive and energy metabolism. In this study, ghrelin gene of Monopterus albus was cloned. Its structure and function were analysized preliminarily. By Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE) technique, full-length cDNA and DNA sequences of ghrelin gene were obtained. The full-length ghrelin cDNA(GenBank accession no. JX122807) was 552 bp long, containing a 115 bp 5'-untranslated region, a 324 bp open reading frame and a 113 bp 3'-untranslated region. The full-length ghrelin DNA was 1 323 bp, consisting of three introns and four exons. The exon/intron junction sequences conformed to the GT/AG rule. Three introns were 594, 84 and 93 bp in length, respectively; four exons were229, 78, 112 and 133 bp in length, respectively. The results of amino acid sequence analysis showed that the deduced propreghrelin sequence of M. albus contained a signal peptide(SP) consisting of 22 amino acid residues, a mature peptide(MP)consisting of 19 amino acid residues and a C-terminal amino acid residue. Among them, the third amino acid of MP was serine(Ser~3) as the site for N-acylation and N-deacetylation reactions; the C-terminal amino acid residue sequence might contain a peptide hormone obestatin, which is a physiological antagonist of mature Ghrelin peptide. The homology and phylogenic relationships analyses of amino acid sequences suggested that propreghrelin of M. albus had high similarity to those of several Perciformes fishes; the propreghrelins of M. albus, Perciformes and Heterosomata fishes were clustered into a subgroup. The high conservatism of the gene structure and the amino acid sequences indicated that Ghrelin exerts important physiological functions and plays similar physiological mechanisms in vertebrates.     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.     

草菇Volvariella volvacea中乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因vv-pyrG的克隆和序列分析

运用简并PCR和基因组步行技术克隆常见食用菌草菇的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因（vv-pyrG基因）,并运用生物信息学和系统发育学的方法对所获得的基因进行了序列分析。结果显示：vv-pyrG基因的编码区长度为920bp,含有2个长度分别为65bp和54bp的内含子,可以编码1个含有266个氨基酸残基的蛋白质序列。该氨基酸序列经比对分析,显示与裂褶菌（Schizophyllum commune）和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）的OMPDC序列的相同性分别为58％和64％,相似性分别为74％和78％。对24种真菌的OMPDC氨基酸序列进行系统发育分析表明,系统进化树中草菇与灰盖鬼伞、裂褶菌、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）和白腐菌（Phanerochaete sordida）聚在一起,在节点上的支持率是97％。     

草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析

 用RACE技术从受精后约22 h的草鱼胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD基因的全序列,并对其序列进行了分析。结果表明，草鱼MyoD基因全长cDNA为1 597 bp,其中开放阅读框为825 bp，共编码275个氨基酸，结构分析表明该肽链第1～84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域，该序列所编码的肽链没有信号肽；通过对比分析已知的GeneBank中其它脊椎动物MyoD基因发现，该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致；草鱼MyoD基因的克隆为研究家鱼的肌肉发育调控的机理以及肉质改良奠定了基础。     

大麦条纹花叶病毒中国株基因组RNA1的全长序列分析

 【目的】获得大麦条纹花叶病毒中国株（BSMV-CH）基因组RNA1的全长cDNA,进行序列分析,明确与国外报道株系间的亲缘关系和分类地位。【方法】以自然侵染BSMV-CH的大麦叶片中提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法获得BSMV-CH RNA1的全长cDNA,克隆到载体pMD18并测序,用DNAstar软件将获得的序列与GenBank登录的BSMV RNA1序列进行对比,分析各株系序列RNA1之间的同源性,构建系统发育树分析BSMV-CH与国外株系间的亲缘关系。【结果】BSMV-CH的RNA1全长为3 795 bp（GenBank注册号：AY789693）,基因组RNA1 5′端有一个甲基化的帽子结构,3′端有一个PolyA结构和一段239 bp长的类似tRNA的保守序列,BSMV-CH基因组RNA1含有一个长度为3 417 bp的ORF,推测可编码一个1 138个氨基酸的复制酶基因。BSMV-CH的基因组RNA1与国外报道其它株系核苷酸的同源性为95.4%～95.6%。复制酶基因同其它株系核苷酸和氨基酸的同源性分别为94.9%～95.2%和96.5%～96.8%,PolyA的长度比其它株系明显要长。【结论】BSMV-CH和CV42与CV17、ND18、TSE及TSG间的亲缘关系明显低于CV17、ND18、TSG和TSE间的亲缘关系;BSMV-CH与CV42表现相对较近的亲缘关系,但BSMB-CH是不同于CV42的一个BSMV新株系。     

松江鲈β-肌动蛋白基因全长cDNA的克隆和序列分析

[目的]获得松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并检测松江鲈β-肌动蛋白在组织中的表达。[方法]以松江鲈肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE的方法扩增β-肌动蛋白基因cDNA片段,用RT-PCR方法检测组织表达。[结果]获得了松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA的3个片段,测序后拼接得到1 905 bp全长cDNA序列,其包含了1 128个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性分析发现,松江鲈β-肌动蛋白基因序列与点带石斑鱼、军曹鱼、红鲷鱼等同源性相对较高,与哺乳动物和鸟类同源性相对较低;系统发育分析表明,松江鲈β-肌动蛋白与点带石斑鱼关系最近。RT-PCR分析表明,该基因在检测的肌肉、肝脏、肠和脑4种组织均有表达。[结论]首次得到了β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并证明了松江鲈的β-肌动蛋白基因非常保守。