阿米卡星对嗜水气单胞菌的体外药效学研究

为了研究阿米卡星对嗜水气单胞菌的抗菌活性,试验采用试管双倍稀释法测定了阿米卡星对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),从研究不同培养条件对阿米卡星抗嗜水气单胞菌活性的影响以及不同浓度阿米卡星的杀菌动力学曲线。结果表明:阿米卡星对嗜水气单胞菌的MIC为1.6μg/mL,MBC为6.4μg/mL,MBC与MIC的比值为4;随着培养基pH值的升高,阿米卡星抗菌活性升高;随着Mg2+浓度的增加,阿米卡星的抗菌活性逐渐减弱;随着血清浓度的增高,阿米卡星的抗菌活性逐渐减弱;随着细菌接种量的增加,阿米卡星的抗菌活性降低;阿米卡星对嗜水气单胞菌的杀菌曲线表现为2倍MIC、5倍MIC和8倍MIC阿米卡星在1h内的杀菌活性基本相同,随着时间的增加,2倍MIC阿米卡星的杀菌活性开始降低,而5倍MIC和8倍MIC阿米卡星仍然保持着高效的杀菌活性。     

乌鳢体表粘液抗菌肽CSM14的分离纯化及部分生物学活性研究

为建立分离纯化乌鳢体表粘液抗菌肽的方法并研究其抗菌活性,本研究通过嗜水气单胞菌对乌鳢进行刺激,采用甲醇提取、SephadexG-50凝胶层析和反向高效液相色谱从其体表粘液中提取抗菌肽,经质谱分析测定分子量;并对抗菌肽的抑菌谱、最小抑菌浓度(MIC)、热稳定性、溶血活性进行了初步研究。结果表明:分离纯化的乌鳢体表粘液抗菌肽分子量约为3024.15ku,并具有广谱的抗菌活性,热稳定性好,没有溶血活性。     

大口黑鲈不同组织中抗菌肽粗提及抑菌活性测定

研究了大口黑鲈不同组织中抗菌肽的提取及其粗提物对不同菌种的抑菌作用。以新鲜的大口黑鲈为试验材料,用5％乙酸作为提取液,对大口黑鲈粘液、皮肤、肝脏、脾、卵、鳃组织进行提取,并对粗提物进行抑菌活性检测。结果表明大口黑鲈粘液、皮肤和肝脏组织提取物对嗜水气单胞菌有抑菌作用,皮肤和肝脏组织提取物对大肠杆菌有抑菌作用。肝脏组织抗菌肽提取物经SephadexG-25凝胶过滤层析柱分离后,其收集液对嗜水气单胞菌仍具有抑菌作用。大口黑鲈皮肤和肝脏组织提取物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌均有抑菌作用。     

鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性及作用机制研究

为探讨鲎素对嗜水气单胞菌的抑杀作用,采用最小抑菌浓度、AB染料、扫描电镜、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等方法研究鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性、杀菌率、胞内紫外物质泄露、膜负电荷数、外部形态结构及胞内基因组DNA的影响。结果表明,鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性较其他细菌弱;2倍最低杀菌浓度(MBC)鲎素能在短时间内迅速杀死嗜水气单胞菌并导致胞内生物大分子泄漏;扫描电镜发现1倍MBC鲎素能导致轻微的壁膜破损及一些胞内物质渗出和粘连;流式细胞仪结果表明,1倍MBC鲎素能破坏细胞膜的完整性;AB染料测定表明鲎素处理后能改变膜负电荷数;琼脂糖凝胶电泳表明,鲎素能够与嗜水气单胞菌的基因组DNA发生作用,并呈浓度依赖关系,浓度越高对细菌基因组DNA损伤越大。鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性弱,只有高浓度时才能短时间内导致胞内紫外吸收物质泄露、膜负电荷数发生改变及基因组DNA损伤。     

暹罗鳄外周血白细胞提取物抗菌活性的初步研究

用离心和细胞破碎沉淀法提取暹罗鳄外周血白细胞的抗菌活性物质,测定其对10种细菌的体外抗菌活性。结果表明：暹罗鳄外周血白细胞提取物对埃希氏大肠杆菌、海豚链球菌、多杀性巴斯德菌、温和气单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌10种细菌均有一定的抗菌效力;其中,对海豚链球菌的抗菌效力最强,抑菌圈达22．1mm;对大肠杆菌的抗菌效力次之,抑菌圈达21．7mm;对霍乱弧菌的抗菌效力较弱,抑菌圈为7mm。实验还测定了理化因子对暹罗鳄外周血白细胞提取物抗菌活性的影响,发现其具有酸溶性、EDTA敏感性和热稳定性等特点。据此特点,初步确定暹罗鳄外周血白细胞中所含的抗菌活性物质是抗菌肽。比较了暹罗鳄外周血白细胞和密西西比红耳龟、花田鸡外周血白细胞提取物的抗菌效力的强弱,发现前者对于实验所用10种细菌的抗菌效力明显强于后两者;其中,对链球菌的抗菌效力,暹罗鳄外周血白细胞提取物最强,抑菌圈达21．3mm,密西西比红耳龟外周血白细胞提取物次之,抑菌圈为5．3mm,花田鸡白细胞提取物最弱,抑菌圈为0．67mm。说明暹罗鳄外周血白细胞中存在一种或数种具有广谱、高效的抗菌活性物质。     

中西药联用对嗜水气单胞菌体外抑菌作用研究

为了探讨中西药联用对舌鳎源嗜水气单胞菌的体外抑菌效果,试验采用水提法提取中草药有效成分,用试管二倍稀释法分别测定黄柏、黄芩、知母、连翘、阿米卡星、环丙沙星6种药物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC),用微量肉汤棋盘稀释法测定中西药联用对嗜水气单胞菌的联合抑菌指数(FIC)。结果表明:这6种药物对舌鳎源嗜水气单胞菌均有不同程度的抑制作用,单独使用时以阿米卡星抑菌效果较好。此外,在8种药物组合中:阿米卡星+黄柏及环丙沙星+黄柏为颉颃作用;阿米卡星+知母及环丙沙星+连翘为无关作用;环丙沙星+知母、阿米卡星+黄芩、阿米卡星+连翘、环丙沙星+黄芩为相加作用。说明中西药联用对由嗜水气单胞菌引起的细菌病具有一定的作用。     

喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌体外生物被膜形成能力的影响

采用微量肉汤稀释法测定3种喹诺酮类药物对21株嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC),体外建立其生物被膜(BF),采用结晶紫法和扫描电镜的方法研究生物被膜的形成和结构,并观察喹诺酮类药物对生物被膜形成能力的影响。结果表明:喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌有较强的抑制作用,诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的抑菌率分别为90.5%,95.25%和85.7%,其中环丙沙星的抑菌作用最强,对21株菌的最小抑菌浓度均在0.7813μg/mL以下。21株嗜水气单胞菌均可在24～48 h内体外形成较为稳定的BF,但不同菌株之间形成BF的能力有所不同。嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物较为敏感,环丙沙星浓度在1倍MIC以上即可抑制嗜水气单胞菌生物被膜的早期形成,但细菌形成成熟的生物被膜后,较高浓度药物对生物被膜的影响不明显。     

库拉索芦荟提取物对两种气单胞菌的抑菌作用

为探究库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的抑菌作用,采用醇提法提取库拉索芦荟得到芦荟提取物,使用二倍稀释法和K-B法测定库拉索芦荟提取物对两种气单胞菌的抑菌作用,再用嗜水气单胞菌回感鲫鱼,并用库拉索芦荟提取物对患病鲫鱼进行治疗。结果显示:库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为95 mg/mL,最小灭菌浓度(MBC)为105 mg/mL;对维氏气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为62 mg/mL,最小灭菌浓度(MBC)为65 mg/mL。库拉索芦荟提取物对维氏气单胞菌的抑菌效力与强力霉素、红霉素、奥复星相当,抑菌环直径均为16 mm。嗜水气单胞菌攻毒试验中,对照组鲫鱼死亡率高达100%,而库拉索芦荟治疗组的鲫鱼死亡率降低至20%。库拉索芦荟提取物对嗜水气单胞菌与维氏气单胞菌有良好的抑菌效果。     

植物精油对嗜水气单胞菌和无乳链球菌的抑菌效果

本研究旨在通过在细菌培养基中添加不同浓度的植物精油产品"智然香"和抗敌素,接种嗜水气单胞菌和无乳链球菌,探求植物精油产品"智然香"和抗敌素对两种水生致病菌的最低抑菌浓度。试验方法:采用琼脂平板法,在培养基中添加不同浓度的植物精油产品"智然香"和抗敌素,分别接种嗜水气单胞菌和无乳链球菌,测定植物精油产品"智然香"和抗敌素对细菌的抑制效果和最低抑菌浓度。结果表明:植物精油产品"智然香"和抗敌素对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度分别为2%和0.7%,对无乳链球菌的最低抑菌浓度分别为4.6%和1%。植物精油产品"智然香"可以以较小浓度抑制嗜水气单胞菌的生长,可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制。     

重组表达抗菌肽Hadrurin抗菌活性分析

为了给表达高活性的抗菌肽Hadrurin提供开发应用的依据,进一步为用基因工程方法生产具有多种生物活性的抗菌肽Hadrurin蛋白提供研究基础,本研究表达获得重组抗菌肽Hadrurin(rHadrurin)蛋白的基础上,将纯化的rHadrurin蛋白进行肠激酶酶切,恢复其天然活性结构。用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)方法检测抗菌肽Hadrurin在不同剂量、不同pH值、不同保存温度下对鸡致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性及杀菌活性。并以小鼠为动物模型,进行抗菌肽rHadrurind对小鼠的体内保护实验。结果表明抗菌肽rHadrurin对上述细菌的最小抑菌范围为1.32μg/mL～4.32μg/mL,最小杀菌范围为1.77μg/mL～8.54μg/mL,而且-70℃～100℃及在pH3～pH10条件下仍具有高效抗菌活性。240μg/只剂量的抗菌肽蛋白可有效预防保护小鼠免受致死剂量鸡致病性大肠杆菌攻击,320μg/只剂量可达到保护率85%以上。     

Design and Activity Identification of Hybrid Peptide Based on Cecropin A and Mastoparan

In order to further improve mastoparan's antibacterial and antitumor activities and reduce its cytotoxicity,the molecular modification was carried out by molecular hybridization,and the biological activity of the designed peptide was identified.A novel hybrid peptide KL-21 was obtained by using the N-terminal 1-8 sequences fragment of cecropin A and the conserved sequence of mastoparan.The physicochemical parameters and structures of KL-21 were analyzed by bioinformatics method.The antibacterial activity of KL-21 was studied with MP-L as reference.In addition,the hemolysis rate of the two peptides and the activity of anti-tumor cell A549 were measured.The results showed that KL-21 could quickly kill bacteria in a shorter time.The minimum inhibitory concentration (MIC) of KL-21 to Gram-positive bacteria (S.aureus) and Gram-negative bacteria (E.coli) was 4-8 μg/mL,and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 8-16 μg/mL.The MIC and MBC of KL-21 to fungus (C.albicans) were 32 and 64 μg/mL,respectively.The hemolytic activity of KL-21 was only 20% at 128 μg/mL,which was lower than that of MP-L.KL-21 could inhibit lung cancer cell A549 with inhibition rate in vitro about 86% at 16 μg/mL.These results indicated that KL-21 had higher antibacterial and antitumor activity and lower cytotoxicity than MP-L,which could be used as a leading peptide for further research and development.     

基于天蚕素A和胡蜂毒素的杂合肽设计及活性鉴定

为了进一步改善胡蜂毒素（mastoparan,MP）的抗菌、抗肿瘤活性并减少细胞毒性,本研究通过分子杂合方法对其进行改造,并初步鉴定设计的杂合多肽的生物活性。以天蚕素A的N-端1-8序列片段和胡蜂毒素的保守序列为模板进行杂合设计,获得一条新型杂合肽KL-21。以胡蜂毒素MP-L作为参照,采用生物信息学方法、微量倍比稀释法、杀菌动力学方法、溶血试验、CCK-8法分别对KL-21和MP-L进行理化参数分析、结构预测、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定、杀菌动力学研究、溶血活性测定及肿瘤细胞毒性试验。结果表明,KL-21可以在短时间内迅速杀灭细菌,对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性菌（大肠杆菌）的MIC均为4~8 μg/mL,MBC均为8~16 μg/mL;KL-21对真菌（白色念珠菌）的最小MIC为32 μg/mL,MBC为64 μg/mL。兔红细胞溶血试验表明,KL-21在128 μg/mL时溶血活性仅为20%,较MP-L的溶血活性明显降低。细胞毒性试验表明,KL-21对肺癌细胞A549具有良好的抑制作用,16 μg/mL的体外抑制率达86%。研究表明,新型杂合肽KL-21较MP-L的抗菌和抗肿瘤活性有较大提高,细胞毒性显著降低,可以作为先导肽进一步研究和开发。     

抗菌肽BSN-37的抑菌活性及其稳定性分析

试验旨在研究抗菌肽BSN-37的抑菌活性和稳定性。采用微量倍比稀释法测定抗菌肽BSN-37的最小抑菌浓度(MIC),菌落计数法分析抗菌肽BSN-37对大肠杆菌CVCC1568的杀菌动力学特征,扩散法测定抗菌肽BSN-37的盐离子稳定性、酸碱稳定性、血清稳定性、胰酶稳定性、热稳定性、反复冻融稳定性、室温保持稳定性、药效保持时间稳定性。结果显示,抗菌肽BSN-37对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的MIC为1.5625～25μg/mL,对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)的MIC为1.5625～12.5μg/mL,对真菌(白色念珠菌)没有活性;抗菌肽BSN-37可在90min内完全杀灭大肠杆菌CVCC1568;除了Fe2+和胰酶会影响抗菌肽BSN-37的抑菌活性外,在75～100℃的高温、150～250mmol/L高浓度盐离子(Na+、K+、Ca2+和Mg2+)、20%～25%饱和浓度的Cu2+、pH 4～10、20%～25%的血清、10～12次的反复冻融、10～12d室温保存等条件下仍能保持较好的抑菌活性,药效保持时间可达7.5d。本试验结果表明,抗菌肽BSN-37具有替代抗生素成为新抗菌药物的潜力,为抗菌肽BSN-37的临床应用提供了理论依据。     

克蚕菌的体外抗菌活性研究

以试管稀释法、活菌计数法检测了克蚕菌体外最低抑菌浓度 (MIC)及最低杀菌浓度 (MBC)等 ,结果显示克蚕菌对苏云金杆菌、卒倒杆菌、青头败血病菌、八联球菌和产气杆菌的MIC和MBC分别为 0 5 μg/mL和 8.0 μg/mL。不同细菌接种量、不同家蚕血清含量和不同pH值对克蚕菌的抗菌活性略有影响。克蚕菌具有较强的体外抗菌活性。     

人工设计天蚕素抗菌肽AMP-D及其活性测定

本试验通过对抗菌肽结构改造优化,得到了一条新设计的抗菌肽AMP-D,并利用固相合成技术人工合成后对其活性和溶血性进行测定。试验结果表明,AMP-D对革兰氏阴性菌及真菌没有生物活性,对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用,且其没有溶血活性;AMP-D对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为10.5 μg/mL,较原设计肽活性有较大提高。     

茶多酚抑菌作用的研究

以食品行业常见细菌和真菌为研究对象,采用平板稀释法和滤纸片法测定了茶多酚对一些细菌和真菌的抑菌活性。结果表明:茶多酚对供试细菌有较强的抑菌活性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC100)均为0.9μg/mL,而对铜绿假单胞杆菌的最低抑菌浓度(MIC100)为1.3μg/mL;而茶多酚对供试的黄曲霉、点青霉和黑根霉均无明显的抑菌作用。     

头孢喹诺对几种常见动物病原菌的体外抗菌作用

采用微量肉汤稀释法测定国产头孢喹诺对5种常见动物病原菌的最小抑菌浓度(MIC),并与头孢噻呋、氨苄西林及环丙沙星进行比较。结果显示头孢喹诺对金黄色葡萄球菌的MIC为1~2μg/mL,抗菌活性强于其他3种药物;对大肠杆菌的MIC≤0.031~0.25μg/mL,抗菌活性与环丙沙星相近,高于头孢噻呋和氨苄西林;对链球菌的MIC≤0.031~1μg/mL,抗菌活性与头孢噻呋和氨苄西林相近,高于环丙沙星;对多杀性巴氏杆菌以及胸膜肺炎放线杆菌的MIC分别≤0.031~0.5μg/mL和≤0.031μg/mL,抗菌活性与头孢噻呋和环丙沙星相近,强于氨苄西林。结果表明头孢喹诺对革兰氏阳性和阴性菌均具有强大的体外抗菌作用。     

牛血红蛋白β亚基片段衍生抗菌肽的分子设计及其抗菌活性分析

【目的】 试验旨在获得分子质量小、溶血性低、稳定性好的抗菌肽。【方法】 以牛血红蛋白β亚基的氨基酸序列为基础,以抗菌肽的构效理论为指导,筛选出1条多肽（YKK-18）,并以其为模板肽设计了3条长度为18个氨基酸残基的改造多肽（LJ-1、LJ-2和DLK-3）,通过最小抑菌浓度的测定反映4条多肽的抗菌活性,采用琼脂糖扩散法分析有抗菌活性多肽的热稳定性、酸碱稳定性、盐离子稳定性和反复冻融稳定性,用分光光度法测定有抗菌活性多肽的溶血性。【结果】 设计的4条多肽均为带正电荷的亲水性多肽,与APD3数据库中收录的抗菌肽氨基酸序列相似性均低于50%,二级结构中均有较高含量的α-螺旋,改造多肽的两亲性程度均高于模板肽,模板肽对测试菌株没有抗菌活性,而改造多肽对测试的大肠杆菌、沙门菌、绿脓假单胞菌、葡萄球菌、白色念珠菌等均有不同程度的抗菌活性,其中DLK-3和LJ-1的抗菌活性优于LJ-2,但对奇异变形杆菌均没有抗菌活性,在100 ℃高温、pH 4.0~10.0、生理浓度的盐离子（Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺）和14次反复冻融等条件下仍有较好的抗菌活性,DLK-3的溶血作用呈剂量依赖性,在200 μg/mL时的溶血率已超过50%,而LJ-1和LJ-2的溶血率在高浓度（200 μg/mL）时仍低于5%。【结论】 本研究结果为抗菌肽的分子设计和改造提供了参考,获得的抗菌肽LJ-1和LJ-2具有成为抗生素替代物的潜力。     

In vitro antimicrobial efficacy of β‐defensin 3 against Staphylococcus pseudintermedius isolates from healthy and atopic canine skin

β‐Defensins (BDs) are highly conserved antimicrobial peptides important in innate defence against bacteria. β‐Defensin 3 has a specific role in protecting the skin. This study quantified the minimal inhibitory concentration (MIC) of human (h)BD3 against Staphylococcus pseudintermedius isolates from atopic and healthy dogs. Single colony isolates (1 × 10⁵ colony‐forming units/mL log phase) were cultured with doubling dilutions of hBD3 in sodium phosphate buffer from 0.8 to 50 μg/mL at 37 °C for 2 h, before adding 100 μL of tryptone soy broth and incubating for a further 20 h. Bacterial growth was assessed as the mean optical density at 540 nm corrected for background. The median MIC was 12.5 μg hBD3/mL (range 3.125–25 μg/mL; n = 22). Forty‐five percent of the isolates were inhibited at ≤6.25 μg hBD3/mL, and 90% were inhibited at ≤12.5 μg hBD3/mL. Bacterial growth was not inhibited at ≤1.6 μg hBD3/mL. There were no significant differences in the inhibition by hBD3 of isolates from atopic (median MIC 12.5 μg/mL, range 6.25–25 μg/mL, n = 14) and healthy dogs (median MIC 9.4 μg/mL, range 3.125–12.5 μg/mL, n = 8); from noninfected colonized sites (median MIC 12.5 μg/mL, range 3.125–25 μg/mL, n = 16) and infected lesions (median MIC 9.4 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 6); or between sample sites (nose median MIC 12.5 μg/mL, range 6.25–25 μg/mL, n = 5; perineum median MIC 12.5 μg/mL, range 3.125–25 μg/mL, n = 7; ear median MIC 6.25 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 4; lesions median MIC 9.4 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 6). In conclusion, hBD3 inhibited the growth of canine S. pseudintermedius isolates in vitro irrespective of origin.     

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。