重组N蛋白抗原检测美洲型PRRSV抗体间接ELISA方法的建立

利用表达纯化的PRRSV特异N蛋白抗原表位基因的重组融合蛋白作为抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。研究结果表明重组N蛋白的最适包被浓度为4.5μg/mL,最适包被条件为37℃1 h加4℃过夜,待检血清稀释度为1:40,HRP-兔抗猪IgG(1:1000)37℃孵育30min。经重复性试验、交叉试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高,与武汉科前ELISA试剂盒的符合率达93.2%。用已建立的方法检测2007年以前临床血清样本983份,总阳性率为48.6%。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒截短GP5蛋白间接ELISA方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。     

猪伪狂犬病病毒野毒抗体胶体金免疫层析试纸条的初步应用

为建立一种简单、快速、敏感、特异的猪伪狂犬病病毒野毒抗体血清学检测方法,本研究利用胶体金标记SPA蛋白作为金标垫,以重组g E蛋白和猪Ig G分别作为检测线和质控线,组装检测猪伪狂犬病病毒g E抗体的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条肉眼于15 min内即可判定结果,检测PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的灵敏度达1∶1 280,与IDEXX g E-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为95.31%,室温条件下可稳定保存6个月以上。本研究研制的PRV野毒抗体胶体金免疫层析试纸条操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强,可用于PRV野毒感染的快速诊断,特别适合于现场检测。     

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为：抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为：75%、80.7%和79%。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因在大肠杆菌中的表达及gE-ELISA鉴别诊断方法的建立

试验以pPGEDNA为模板，用1对分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的伪狂犬病病毒gE基因特异性引物，扩增出约1．7kb的含完整gE基因的DNA片段；目的片段经EcoR I和BamH I双酶切后，插入原核表达载体pBV220得到重组表达质粒pBVgE，并转化大肠杆菌DH5a；对温敏诱导表达所获产物进行SDS—PAGE、Western—Blot和琼脂双扩散检测。结果表明，gE糖蛋白得到了高效表达，表达产物约占总蛋白的17％。为了鉴别伪狂犬病疫苗免疫猪和自然感染猪，用表达纯化的gE蛋白为抗原，建立了GE—ELISA方法。选定的反应条件包括GE抗原包被浓度为6.6mg／L，血清最适稀释度为1：40。测试结果：与PRV、HCV、PRRSV、JEV、SA215阳性血清呈阴性反应，而与PRV标准阳性血清呈阳性反应。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于猪伪狂犬病的临床诊断，尤其疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

猪肺炎支原体融合蛋白MHP-P46-P36的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

利用生物学软件分析猪肺炎支原体P46蛋白和P36蛋白的抗原决定簇,将抗原表位富集区进行串联,表达融合蛋白MHP-P46-P36。以融合蛋白MHP-P46-P36作为包被抗原,优化反应条件建立肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示：融合蛋白MHP-P46-P36以可溶性形式高效表达;ELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度10 mg/L, 1%BSA封闭60 min,一抗最佳稀释度1∶40且37℃60 min,二抗最佳稀释度1∶4 000且37℃60 min,最适显色时长15 min, cut-off值为D_{450 nm}=0.385;与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性;阴阳性血清的组内和组间变异系数均小于7%,具有较好重复性;52个样品临床样本检测结果显示,建立的ELISA方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒相比,阳性样本的符合率为83.09%。     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1：2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%~9.47%,批间变异系数为2.43%~14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）的基因序列,在ＰＲＶｇＥ基因阅读框外的上、下分别设计一对引物Ｐ１和Ｐ２,在引物的 ５’端分别加上 ＫｐｎＩ和 ＥｃｏＲＩ位点。以 ＰＲＶ Ｆａ株的 ＤＮＡ为模板成功地扩增得到一条长的 １．７ｋｂ的片段,经酶切鉴定,初步确定为ｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物经ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ消化后与同样酶切的ＰＵＣ１８质粒连接、转化,得到了明显大于载体的重组质粒ＰＰｇＥ。重组质粒ＰＰｇＥ经酶切鉴定确定为含有ＰＲＶ 的 ｇＥ基因,测序ＰｐｇＥ得到完整的ｇＥ基因片段,并与４株不同来源的毒株进行了比较分析。在对 ＰＲＶ Ｆａ（来自福建）、Ｒｉｃｅ（来自俄国）、ＴＮＬ（来自台湾）、Ｅａ（来自武汉）、ＳＨ（来自上海）的ｇＥ同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达９７％,这一定程度上也体现ｇＥ基因组的保守性。分析还表明Ｆａ与ＴＮＬ同源。同时９９％的高同源性也显示 Ｆａ、Ｅａ、ＳＨ可能是同一毒株。本实验认为 ｇＥ序列在 １０４０－ １４１０碱基的高同源性区域作为ＰＣＲ检测或核酸探针是非常有用的。     

伪狂犬病病毒gE基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

以质粒pBV222/gE为模板,经PCR扩增出750 bp的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段,克隆入pET-41b质粒中并转化大肠埃希菌TG1。经PCR、酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒pET41b/gE后,转化表达菌Balgold,IPTG诱导,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析检测。以纯化后的目的蛋白作包被原,建立间接gE-ELISA检测方法。结果表明,目的基因在30℃,0.025mmol/LIPTG诱导条件下,可在Balgold中高效表达,目的蛋白大部分以可溶性形式存在,并能被PRV阳性血清所识别,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(800倍)和包被抗原的最佳工作浓度(1 mg/L)。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。     

基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR法快速诊断猪伪狂犬病的研究

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(PRV)的方法,试验采用PCR法,并以NCBI公布的PRV Min-A株(登录号为AY170318.1)的gE基因序列为参考序列设计1对特异性引物,进行PRV基因的扩增,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明:该PCR检测方法扩增的目的基因长348 bp;应用此方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)进行PCR扩增均未有条带出现;该方法能够检测到的最低DNA模板量为10 pg;重复性良好;应用此法对43份临床样品进行检测,检出率为65.12%(28/43)。说明该PCR检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料检测和分子流行病学调查等。     

猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析

根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支     

利用杆状病毒表达系统表达PRV/gE蛋白及间接免疫荧光抗体(IDF)检测方法的建立

为了建立高效灵敏的伪狂犬病病毒(PRV) gE蛋白的间接免疫荧光抗体诊断方法,本研究将PRV/HN/SMX/2012毒株gE蛋白的自身信号肽及胞外域片段克隆到pFastBacHT B载体上,构建重组质粒pFastBacHTB-gE,并转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过3次蓝白斑筛选获得含有gE基因的重组杆粒rBacmid-gE。随后,将该杆粒转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rAcMNPV-gE。经Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)进行鉴定分析,发现重组gE蛋白在sf9细胞中表达。利用该sf9细胞建立检测血清中gE抗体的间接免疫荧光抗体(IDF)方法,通过反应条件的优化发现,将血清和羊抗猪FITC-IgG分别进行1∶40和1∶2 000稀释时所建立的方法能针对血清中gE抗体产生较强的特异性荧光;通过与商业化的ELISA检测gI/gE试剂盒(IDEXX)比较,所建立的检测方法与商业化试剂盒的总符合率为93.18%(164/176),阳性结果符合率93.75%(120/128),阴性结果符合率91.67%(44/48),2种方法存在很强的一致性(Kappa=0.832,CI=95%);-20℃条件下保存2个月的稳定性和重复性良好。     

2013年-2017年陕西省猪伪狂犬病病毒分子流行病学调查与gE基因序列变异分析

调查2013年-2017年间陕西省猪伪狂犬病流行情况,并对流行毒株gE基因进行测序分析,为猪伪狂犬病防控提供参考。采用套式PCR,检测了陕西9个地市、556个存在繁殖障碍现象猪场的1 390份样品中PRV感染情况,通过Vero细胞传代分离到11个PRV地方流行毒株,并进行了gE基因片段克隆与序列分析。2013年-2017年间陕西存在繁殖障碍的猪场中PRV感染阳性率38.1%~83.3%,样品阳性率46.5%~85.3%。11株PRV核苷酸同源性为99.2%~100%,氨基酸同源性为98.3%~100%,提示这11个PRV流行毒株高度同源。在测定的118个氨基酸位点中,有6个位点与参考序列存在一定差异,分别是T/I31→S31、Q33→L33、Q52→R52、L/R67→A67、A68→D68和T115→R/P/S115。基因进化树分析显示,11株PRV亲缘关系很近,集中分布在一个小的分支上,与我国福建流行毒株Min-A关系密切,与欧美毒株亲缘关系较远。陕西省采样猪场表现出PRV感染率高、感染强度大的特点,gE基因出现多个点突变,且变异趋势相同,形成了一个独立的进化分支。     

2020年北疆部分地区猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体ELISA检测与分析

为了解2020年1—12月北疆部分地区猪伪狂犬病野毒株（PRV-gE）感染情况,采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法对从北疆4个地区采集的657份猪血样进行PRV-gE蛋白抗体水平检测。结果显示,4个地区PRV-gE抗体阳性率为29.83%（196/657）,乌苏地区与其他地区的抗体水平存在一定差异（P<0.05）;各猪场中A场的阳性检出率最高,为83.78%（62/74）;D场和H场的阳性检出率最低,为0.00%;不同类别猪群中,保育猪的PRV-gE蛋白抗体阳性率最高,为46.77%（29/62）;哺乳仔猪抗体水平与其他猪群均存在一定差异（P<0.05）。试验表明,各个猪群均存在野毒感染情况,各养猪场之间、不同生长阶段感染情况不一。该试验可为北疆地区猪场PR防控与净化提供参考。     

猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒二联PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）2种病原体的基因保守序列，分别设计并合成了与PRv的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物，进行单相PCR，分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段；同时，用这两对引物对混合的样品中的PRV和PPV的DNA模板进行二联PCP扩增及二联PCR反应条件的优化，结果得到2争与试验设计相符的217bp（PRV）和158bp（PPV）特异性务带：敏感性检测结果表明，对PRv的检测可以达到10^6.11／20μL TCID50对PPV的检测可以达到0．008HA单位的核酸模板。本文建立的PCR方法，可以在24h内对样品进行快速检测，可作为PRV、PPV感染和临床样品检测的可靠手段。