3种重要鸡肿瘤病的鉴别诊断

鸡的肿瘤性疾病主要包括禽白血病、马立克氏病以及禽网状内皮组织增殖病。这些肿瘤病的共同特点是在鸡的组织器官中产生实质性或弥散性肿瘤,机体严重免疫抑制,严重危害我国养禽业的发展。为了快速鉴别不同肿瘤病,本文对3种肿瘤病的病原学、流行病学、临床症状以及鉴别诊断进行了综述,并明确了在肿瘤病鉴定过程中,不仅要检测到相应病原,更要注意检测肿瘤细胞中的相关抗原。本文将为从事相关研究的人员提供参考,从而更好地采取相应措施和策略控制这些传染性肿瘤病。     

鸡肿瘤病料中马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的研究

采用细胞培养、间接荧光抗体试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)和斑点杂交(Dotblot)的方法从我国不同地区发生肿瘤的病料中同时进行MDV和REV的分离和鉴定。在分离到的13株MDV野毒株中，有4株培养物既能在IFA中与REV的单抗反应，又可以用PCR扩增出REV的LTR；另有4株培养物能扩增出REV的LTR，但在IFA中却不与REV的单抗反应。结果表明我国MD肿瘤中存在着REV的共感染，且我国MDV某些野毒株的基因组中有可能已经整合进了REV的LTR序列。     

正视鸡的肿瘤病

在养禽业迅速发展的同时,鸡的疾病也越来越复杂,其中鸡的肿瘤性疾病几乎在实行规模化养殖的国家都有发生。可引起鸡群发生肿瘤的病毒有3种,即鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡白血病病毒（ALV）和禽网状内皮增生病病毒（REV）。     

我国鸡群中肿瘤病的发生现状及防治措施

鸡群中可引起肿瘤的病毒有三种，即马立克氏病病毒(MDV)、鸡白血病病毒(ALV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)。长期以来，在鸡群中只要一出现肿瘤，许多人就怀疑甚至断言是马立克氏病，而忽视了其他二种病毒的致病性。ALV的A、B、C、D亚型可在蛋用鸡中诱发肿瘤，而ALV的J亚型则主要在肉用型种鸡中诱发肿瘤。REV在蛋用型和肉用型鸡中均可诱发肿瘤。根据临床病理变化和流行病学特点，虽然可以区别一些典型的马立克氏病或白血病，但近几年来我国鸡群中实际发生的肿瘤的表现在逐渐变化，已很难仅仅根据病变来鉴别诊断究竟哪一种病毒引发的肿瘤。特别是，在同一鸡群中及同一病鸡中，二种不同病毒共感染的现象非常普遍．这更给鉴别诊断带来了难度。为了有效预防控制肿瘤的发生．首先要综合利用常规病理学、经典病毒学、分子病毒学的免疫学技术完成对肿瘤病因的科学的实验室鉴别诊断。     

鸡肿瘤病的鉴别诊断和预防措施

鸡马立克氏病、白血病和网状内皮组织增生症是鸡的三大肿瘤病,近几年来肿瘤病的发病率越来越高。它们可以造成鸡群不同程度的免疫抑制,不仅影响鸡群的生产性能,比如死     

鸡传染性肿瘤病的诊断

在鸡群常见的肿瘤性疾病中有马立克氏病(Marek’s disease，MD)，淋巴细胞白血病(Lymphocyte Leukosis，LL)和网状内皮细胞增殖症(Reticuloendotheliosis，RE)。由于这3种肿瘤病在临床症状及病理变化上很相似，仅靠肉眼观察和光学显微镜下观察很难将这3种病准确快速地鉴别开来，特别是诊断者临床诊断经验不够丰富时常常给疾病的诊断及防治工作带来困难。     

肉种鸡群同时发生三种肿瘤病的诊断

一父母代肉种鸡群于21周龄时死淘突然增加，死淘鸡的主要病症为肝脾肿大，通过病理组织切片观察，初步诊断该鸡群同时存在马立克氏病、淋巴白血病和网状内皮组织增生症三种肿瘤疾病。     

家禽肿瘤病的历史回顾与新的挑战

最常见的传染性家禽肿瘤病毒主要有马立克氏病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）、禽淋巴白血病病毒（ALVs）,其中包括J-亚型禽白血病病毒（ALV—J）。禽病毒性肿瘤的性质决定了它们具有相当的传染性,这一特性造就了这类疾病对养禽环境和种禽资源的严重污染,并导致它们的广泛流行：同时,由于这些传染性肿瘤病毒对鸡体均具有显著的免疫抑制能力,因此,禽病毒性肿瘤对家禽养殖业的危害是双重性的。     

PCR和核酸探针技术诊断MD和RE的比较研究

分别应用聚合酶链反应(PCR)技术和核酸探针的点杂交技术，对临床鸡肿瘤／可疑肿瘤病料分别进行马立克氏病(MD)和禽网状内皮增生症(RE)的检测。结果MD和RE的PCR检测阳性率分别为81．9％和53．3％，探针点杂交检测的阳性率则分别为77．1％和27．1％。研究的结果表明，两种检测技术都有很高的特异性，相比而言PCR技术检测的敏感性更高，而且更快速、操作更简便、成本更低。     

原位杂交检测鸡的马立克氏病

马立克氏病（ Ｍａｒｅｋｓ Ｄｉｓｅａｓｅ, Ｍ Ｄ）是由马立克氏病病毒（ Ｍ Ｄ Ｖ）引起的 Ｔ淋巴细胞肿瘤。本文通过 Ｐ Ｃ Ｒ 方法扩增出长为３３９ｂｐ 的部分ｍ ｅｑ 基因片段,再以随机引物法制备 Ｄｉｇ 标记ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,首次采用原位杂交技术对１２ 例 Ｍ Ｄ 自然发病鸡的内脏组织石蜡包埋切片中的ｍ ｅｑ基因ｍ Ｒ Ｎ Ａ 进行检测。结果显示,ｍ ｅｑ 基因ｍ Ｒ Ｎ Ａ 在肿瘤组织中均有分布,这表明ｍ ｅｑ 基因的 Ｒ Ｎ Ａ 转录本可以作为 Ｍ Ｄ肿瘤的特异性分子标志物。     

禽网状内皮组织增生病病毒和马立克氏病病毒共感染对鸡的致肿瘤作用

用禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和马立克氏病病毒(MDV)共感染肉鸡，研究这2种病毒对鸡的致瘤作用，结果表明肉鸡共感染MDV和REV后13d即可发生死亡．接种后100d死亡率达84％。死亡鸡的肝脏、脾脏、肾脏和心脏等可以形成2种外观明显不同的散在的大肿瘤结节和弥漫性的小肿瘤结节。取发病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏和腺胃等组织样品做连续石蜡切片，HE染色后发现这些脏器均存在2种不同类型的肿瘤细胞增生。对这些连续切片分别用MDV和REV的单克隆抗体进行间接荧光试验，则同1份样品存在可以与REV和MDV分别呈现阳性反应的肿瘤细胞团，结果表明REV和MDV可以在感染鸡的体内分别诱发形成肿瘤。在接种后14、21、28和42d随机采集3只鸡的全血分离MDV和REV，均可以同时分离到MDV和REV。表明REV和MDV的共感染延长了病毒血症的时间。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA探针的制备及初步应用

以猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)病毒 ATCC VR-2 332株基因组为模板 ,通过 RT-PCR扩增出 586bp的 ORF6片段的 c DNA。将该片段克隆进 p GEM-T easy载体 ,转化大肠杆菌 JM1 0 9,成功获得重组质粒转化菌。将重组质粒经 Eco R 及 Sma 双酶切 ,回收到 1个 4 63bp的 c DNA片段 ,并制备出地高辛标记的c DNA探针。特异性检测表明 ,该探针对 PRRS病毒的 PCR产物呈现特异性 ,而对照的 HCV、PPV、PRV的核酸均呈阴性 ;敏感性检测表明 ,该探针对同源 DNA的检出限量为 4 pg。应用该探针对 6株 PRRS病毒北京分离毒及 ATCC VR-2 332株感染细胞进行原位杂交检测 ,结果均呈阳性。以上结果表明 ,该探针可成功用于组织原位杂交检测     

用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测

为了明确FMDV在细胞内的增殖部位,建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法,对试验接种FMDVO／Akesu／58（10^7TCID50）毒株的BHK-21细胞中2～10h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位。选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针,采用尾段标记法以地高辛-11-d UTP标记,用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体。结果显示,从感染FMDV后2～10h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子,这些病毒粒子大多集中在核周围,随感染时间延长阳性染色信号增强。这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的,同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖。     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列,用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针,经生物素标记后,成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA,能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物,而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪,在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究,也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

PCR结合斑点杂交技术在检测禽网状内皮增生病毒中的应用

为评价PCR结合斑点杂交技术在鸡REV检测中的应用价值,采用PCR法制备禽网状内皮细胞增生症病毒特异性地高辛标记DNA探针,同时用PCR技术、斑点杂交方法和PCR产物斑点杂交方法检测了不同地区的病、死鸡的组织样品REV的感染情况。结果表明,PCR产物斑点杂交法的检出率(45.16%,14/31)高于组织DNA直接斑点杂交法(32.26%,10/31),显著高于单纯PCR扩增法(0%,0/31)。PCR结合斑点杂交检测技术能快速、敏感、准确,充分避免PCR中的假阴性和假阳性现象,值得推广应用。     

鸡包涵体肝炎病毒DNA探针的制备及其原位杂交的应用

用限制酶HirdⅢ和Ecorl双切鸡包涵体肝炎六邻体蛋白基因片段重组质粒，得到大小636bp的基因片段，用地高辛标记制备DNA探针，其灵敏度为0．1～0．3ng／μL。用该探针对感染鸡包涵体肝炎病毒的雏鸡肝组织进行原位杂交，结果表明病毒经口感染后12h肝细胞内出现病毒的复制，3～7d时病毒复制明显，9～16d病毒复制减弱。原位杂交表明鸡包涵体肝炎病毒主要定位于核内，同时也可进入胞浆中。地高辛标记鸡包涵体肝炎病毒DNA探针对检测该病毒DNA的灵敏度高，特异性强，操作方便，该探针可用于本病的分子病理学研究和特异性诊断。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测方法的建立

参照GenBank发表的PCV2ORFl基因序列设计了1对引物,利用PCR地高辛探针合成的方法制备了长度为494bp的特异性探针,经检验具有良好的特异性和敏感性,可检测最低质粒DNA质量浓度为0．9728ug／L。用该探针建立了原位杂交组织切片检测方法,并用来检测PCV2感染猪的扁桃体和淋巴结组织,结果表明阳性信号主要存在于巨噬细胞胞浆中,信号强、背景良好,阴性对照无显色,说明该方法可作为PCV2实验室诊断和机理研究的一种有效检测方法。     

我国近10年鸡白血病流行病学报道与研究分析

鸡白血病是由多种亚型鸡白血病病毒引起的一种肿瘤性传染病,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓、萎缩以及肿瘤等,造成较严重的经济损失。自1999年至2009年,该病在我国近80%的省市均有病例报道,其中山东、北京等地报道病例最多;该病近10年持续发展,呈现上升趋势,且有前期肉鸡感染病例为主到近几年的蛋鸡发病或肉蛋鸡同时发病为主的发展趋势,同时对我国一些地方鸡造成严重威胁。在这些感染鸡群中,报道的以J亚型ALV感染为主,但A、B亚型在我国鸡群中的蔓延值得关注。对我国分离30余株的J亚群ALV分析表明,肉鸡上分离的ALV变异较小,而蛋鸡上变异较大。人工感染试验表明,ALV感染后除在一些鸡体内产生具有中和作用的抗体外,而相当部分鸡不产生抗体或产生不具有中和作用的抗体;同时,其他免疫抑制病毒与ALV共感染可进一步降低抗体的产生,加重组织病理学变化。ALV在感染鸡只的多种组织器官上比较检测表明,肾、肝、脾及蛋清、鸡胚均可以得到较高的检出率。目前,使用核酸探针、RFLP及细胞培养病毒分离方法成为临床上鉴别ALV亚型的常用方法,其中细胞培养病毒分离、基因测序技术是最为有效的鉴别方法。这些研究将为我国认知鸡白血病、防制鸡白...     

用原位杂交技术对牛组织中FMDV RNA检测和定位

采用原位杂交技术对6头试验牛易感染组织中的FMDVRNA进行了检测和定位。结果显示，接毒后7～28d4头牛舌上皮组织、7～21d的喉咽部有强阳性染色；接毒后35d的牛及正常对照牛舌上皮没有阳性染色；接毒牛及对照牛的扁桃体、淋巴结和蹄叉等其他组织中均没有阳性染色，表明牛舌上皮和喉咽部上皮组织中感染了FMDV，本研究为进一步阐明FMDV在宿主体内的持续感染机理提供极有价值的线索。     

绵羊肺腺瘤病毒JSRV-2基因探针的制备与原位杂交检测

用地高辛随机引物法标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段，制备探针，用原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病（oPA）的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA，结果表明’OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达，同时也检测到了前病毒DNA，而相应的阴性对照无阳性信号，证实外源性JSRV-NM病毒具有特异性的DNA探针在检测致瘤性前病毒在宿主细胞中的整合具有可信度。