翠冠梨PG基因家族两成员的克隆及其表达与货架期果实软化的关系

以早熟砂梨翠冠果实为材料,克隆了多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因家族中的两成员功PGj和PpPG2。PpPGI cDNA序列全长1793bp,开放阅读框为287-1666bp,DNA序列长2757bp,包括8个外显子和7个内含子,编码一个含有459个氨基酸残基的蛋白,预测的等电点（pI）为8．47,估计的相对分子质量为49...     

柑橘CitERF9和CitAP2-7在不同逆境和外源激素处理下的表达

以‘资阳’香橙(Citrus junos‘Ziyang’)为试材,分别对Cit ERF9和Cit AP2-7进行了分析。结果表明:Cit ERF9基因的开放阅读框(ORF)为735 bp,含有1个外显子,可编码244个氨基酸残基的多肽。Cit AP2-7的开放阅读框为1 080 bp,具有6个外显子,可编码360个氨基酸残基。同源分析结果显示,这两个基因编码的蛋白与大豆、蓖麻、碧桃、苜蓿等植物中的同源蛋白有81%~84%的相似性。实时定量分析表明:Cit ERF9和Cit AP2-7在植株不同组织间的表达具有明显差异。在根中,Cit ERF9受各种胁迫处理诱导,而Cit AP2-7主要受ABA、Na Cl、脱水等的诱导。在叶中,各种胁迫均对Cit ERF9具有诱导作用,其模式与根中相似,而Cit AP2-7的表达则主要受ABA、ACC、Me JA、SA等激素以及低温和Na Cl的抑制。试验结果表明,Cit ERF9和Cit AP2-7参与了激素和非生物胁迫的响应过程。     

杨梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果实中的表达分析

以‘荸荠’和‘东魁’杨梅果实为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到果糖激酶基因MrF RK2的全长c DNA序列。MrF RK2全长1 279 bp,ORF阅读框全长996 bp,3′端非编码区227bp,5′端非编码区56 bp,编码332个氨基酸残基。通过氨基酸序列分析发现Mr FRK2含有pfk B碳水化合物磷酸果糖激酶家族高度保守的1个ATP结合域和2个底物结合域;Mr FRK2与杨树Pt FRK2相似性最高,达到85%。利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达的结果表明,Mr FRK2在‘东魁’杨梅果实的发育早期大量表达,在成熟后期表达量下降,果实成熟初期Mr FPK2表达量‘东魁’显著高于‘荸荠’。果实成熟期间果糖含量‘东魁’显著高于‘荸荠’,与果实成熟期间Mr FPK2的表达量相反。这表明,MrF PK2在杨梅果实成熟期间果糖降解过程中可能起一定作用。     

柿果实扩张蛋白基因cDNA克隆及原核表达

以‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）果实不同发育时期提取的总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE技术扩增得到5个扩张蛋白基因：成熟期CDK-Exp3（1 168 bp）,转色期CDK-Exp4（1 120 bp）和CDK-Exp5（1 018 bp）,膨大期CDK-Exp6（1 129 bp）和CDK-Exp7（1 121 bp）;5个基因的开放阅读框（ORF）均为765 bp,编码254个氨基酸;构建了CDK-Exp3原核表达载体pET-CDK-Exp3,并转化于E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约43 kD的蛋白。     

采后‘琯溪蜜柚’果实柠檬酸合成酶基因的克隆与表达分析

为研究柠檬酸合成酶基因与‘琯溪蜜柚’果实"返酸"的关系,以不同贮藏期‘琯溪蜜柚’果实汁胞为材料,克隆了1个柠檬酸合成酶基因,将其命名为CmCS,其含有1 416 bp开放阅读框,编码具有471个氨基酸的蛋白。生物信息学分析表明,CmCS推导的氨基酸序列与甜橙、川桑等植物的相似度皆大于90%,为稳定的亲水蛋白,亚细胞定位预测其定位于线粒体。结果表明,‘琯溪蜜柚’贮藏期间伴随着有机酸含量逐渐增加,CmCS基因表达量整体先升高后降低,推测其对‘琯溪蜜柚’果实采后有机酸代谢具有一定调控作用。     

‘翠冠’梨大果型芽变的细胞学及相关基因表达研究

【目的】对造成大果芽变的原因进行探讨。【方法】以‘翠冠’和表现出大果性状的芽变‘潘庄大翠冠’为材料,利用荧光AFLP分子标记进行基因组DNA序列差异分析;用流式细胞仪检测‘潘庄大翠冠’的染色体倍性,用石蜡切片技术进行细胞学观察,用实时荧光定量PCR检测相关基因表达分析。【结果】AFLP分析证实‘潘庄大翠冠’为‘翠冠’的大果芽变,果实内在品质无明显差异。流式细胞检测结果显示,‘潘庄大翠冠’为二倍体,与‘翠冠’相同。‘潘庄大翠冠’梨的细胞分裂期从盛花期开始一直到花后24 d,较‘翠冠’长4 d,花后28 d时,果肉细胞层数显著多于‘翠冠’。细胞周期蛋白D3(cyclin D3,CYCD3)在‘潘庄大翠冠’中的表达量显著高于‘翠冠’。细胞周期蛋白A2(cyclin A2,CYCA2)、细胞周期蛋白依赖性激酶A1(cyclin-dependent kinase A1,CDKA1)和细胞周期蛋白依赖性激酶B2(cyclin-dependent kinase B2,CDKB2)等基因也有表达差异。【结论】‘潘庄大翠冠’确为‘翠冠’的大果芽变,其果实增大的机制并非染色体加倍,而是果实发育过程的细胞分裂期细胞的活跃增殖导致细胞分裂期的延长。     

砂梨(Pyrus pyrifolia)过敏原蛋白基因(Ppmal)的克隆与表达分析

【目的】分离和克隆梨过敏原蛋白基因Ppmal(Gen Bank登录号为KP008110),探讨其在梨果实发育过程中的功能。【方法】以砂梨品种‘翠冠’[Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai]为试材,在盛花期后30 d对植株果柄进行涂抹赤霉素处理,利用同源克隆和RACE方法克隆目的基因全长序列,并通过实时荧光定量技术和半定量技术分析该基因在梨不同组织以及梨果实发育过程中的表达变化。【结果】Ppmal的全长是906 bp,含有480 bp的开放阅读框(ORF),编码159个氨基酸,预测的蛋白质相对分子质量为17.56 k D,等电点为5.62。生物信息学分析显示该基因没有信号肽序列,没有跨膜结构域,具亲水性。与其他物种的过敏原蛋白基因核苷酸序列同源性超过75%,与苹果和西洋梨编码的氨基酸序列同源性分别高达97.48%和96.23%,进化树分析表明该基因与苹果的进化关系最近。同时,定量结果显示经过赤霉素处理后的果实中该基因的表达量随着果实的生长发育呈现先降低后升高的趋势,并且具有组织差异表达的特点,其表达量在叶片中最大,其次是嫩叶,再次是花,枝条最低。【结论】获得梨Ppmal基因全长,对该基因在砂梨品种‘翠冠’发育过程中的表达分析显示,Ppmal受到赤霉素的调控,并在砂梨果实膨大期发生上调表达。     

1-MCP对常温贮藏‘红香酥’梨保鲜效果的影响

以‘红香酥’梨果实为试材,研究了常温(20℃)条件下,不同浓度1-MCP处理对果实呼吸强度、乙烯释放量、果实品质和果实腐烂及风味的影响。结果表明:与对照相比,1-MCP处理能明显抑制贮藏期间‘红香酥’果实呼吸强度和乙烯释放量;1-MCP处理能明显延缓‘红香酥’果皮转黄,提高果皮色泽和亮度,提高好果率,贮藏后期保持较好的果实品质和风味,延长贮藏期;1-MCP处理对‘红香酥’果实硬度的影响不明显。常温(20℃)条件下,经0.5μL/L和1.0μL/L 1-MCP处理,‘红香酥’贮藏期可延长12 d以上,果实商品价值好。     

枣甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

以‘金丝小枣’为试材,根据GAPDH基因保守序列设计引物,采用同源克隆和RT-PCR法,克隆枣GAPDH基因并进行生物信息学及转录表达分析。结果表明:该基因包含完整的开放阅读框为1 020bp,编码339个氨基酸残基,预测分子量为36.904kDa,理论等电点为8.53,命名为ZjGAPDH(KP147910);该蛋白包含2个保守结构域,即Gp_dh_N superfamily和Gp_dh_C superfamily;系统进化树分析表明,ZjGAPDH与其它物种GAPDH蛋白的同源性相对较小,但均属于存在细胞质中参与糖酵解过程的蛋白;实时荧光定量分析表明,ZjGAPDH基因在枣果实不同发育时期中表达有显著差异,在幼果期和全红期果实中的表达丰度较高。     

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

1-甲基环丙烯和温度对桃和油桃贮藏品质的影响

 以‘秦光2 号’油桃和‘秦王’桃为试材, 在0 ℃和5 ℃两种贮藏温度条件下研究了1-甲基环丙烯(1-MCP) 对果实呼吸速率、乙烯释放速率、硬度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量及果肉褐变的影响。结果表明, 0 ℃的贮藏温度能显著降低秦光2号油桃和秦王桃的呼吸速率和乙烯释放速率, 减缓果实软化。1μL·L ^-1的1-MCP 处理能降低果实的呼吸速率和乙烯释放速率, 抑制果实软化, 减少果肉褐变,但对可滴定酸和可溶性固形物含量无明显影响。     

1-MCP处理对不同成熟度番茄果实Le-ETR4表达的影响

 以樱桃番茄(Lycopersicon esculentum ) 品种‘卡罗’果实为材料, 研究了1-MCP处理对不同成熟度果实采后20℃贮藏过程中乙烯受体Le2ETR4表达和乙烯释放水平的影响。结果表明: 1-MCP处理可以抑制跃变上升期(破色期) 番茄果实乙烯释放及Le2ETR4表达; 对跃变前期(绿熟) 和跃变高峰期(粉红期) 果实Le2ETR4表达也有抑制作用, 但对乙烯释放无明显影响; 对跃变下降期(红熟期) 果实Le2ETR4表达不仅无明显影响, 反而促进了乙烯释放。     

1-MCP对不同成熟度南果梨贮后货架保鲜效果的研究

以南果梨为试材,研究不同采收成熟度果实经1-MCP处理贮藏60 d后常温货架保鲜效果的差异.试验结果表明:采收成熟度是影响1-MCP对南果梨贮后货架保鲜效果的关键因素,1-MCP对适时采收果实的呼吸强度、乙烯释放量具有显著的抑制作用,显著延缓果实硬度的下降、果皮转色指数的上升,具有显著的果柄保鲜效果.     

1-MCP处理对采后‘澳洲青苹’苹果叶绿素降解的影响

【目的】以‘澳洲青苹’苹果为试材,研究1-甲基环丙烯(1-MCP)对果实采后叶绿素降解代谢的影响,为果实采后贮藏、保鲜及保绿技术提供新的理论基础。【方法】采用1μL·L^-11-MCP处理‘澳洲青苹’苹果果实,定期测定果实色泽、乙烯释放量和呼吸强度,通过高效液相色谱法(HPLC)对果皮中的叶绿素及其降解代谢产物进行定性定量分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测叶绿素降解途径中关键基因的表达水平。【结果】1-MCP处理显著延缓‘澳洲青苹’果皮颜色转变,降低乙烯释放量和呼吸强度。1-MCP处理能保持果皮叶绿素a、b含量处于较高水平,并抑制脱镁叶绿素a和脱镁叶绿酸a的生成。叶绿素降解相关基因MdSGR、MdHCAR、MdPPH和MdNYC1的表达量受到1-MCP的调控,1-MCP抑制基因MdPAO和MdRCCR的表达,推迟叶绿素降解代谢的下游反应;MdPAO表达量与果皮色泽和叶绿素含量显著相关。【结论】1-MCP可调节叶绿素降解途径相关基因表达水平来控制代谢产物的降解和生成,从而延缓果皮叶绿素降解,其中,MdPAO是调控叶绿素降解的关键基因。     

豆梨铵转运蛋白基因PcAMT1-1 和PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定

 为探明豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）铵转运蛋白基因家族成员的序列特征、生理功能和表达特点，以豆梨幼苗为材料，运用电子克隆与3′-RACE 技术获得2 个铵转运蛋白基因PcAMT1-1 和PcAMT1-2，采用酵母互补和半定量RT-PCR 方法研究它们的生理功能与表达特点。结果表明：PcAMT1-1和PcAMT1-2 开放阅读框为1 518 bp 和1 515 bp，编码的蛋白分别含505 和504 个氨基酸残基。PcAMT1-1和PcAMT1-2 分别与甜橙 × 枳后代CpAMT（ABI52423）和茶CsAMT1;2（AB114913）的同源性最高（81.96%和78.31%）。PcAMT1-1 和PcAMT1-2 转入酵母均能使铵转运体缺失突变菌株31019b 恢复NH₄⁺吸收能力，在酸性条件下（pH 4.8 或5.8）PcAMT1-1 和PcAMT1-2 对31019b 的互补效果均优于中性条件（pH 6.8）。NH₄⁺有毒类似物MeA+可以显著抑制转PcAMT1-1 酵母31019b 的生长，该物质对转PcAMT1-2酵母31019b 无抑制效果；谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX 可有效抑制PcAMT1-2 对酵母31019b 的互补效果，对PcAMT1-1 的互补效果无显著影响。正常供铵，PcAMT1-1 主要在叶中表达，PcAMT1-2 主要在根中表达；无氮处理后，PcAMT1-1 和PcAMT1-2 在根中的表达先上调后下降；重新供铵后，它们的表达量恢复；地上部的表达对上述处理无显著响应。综上所述，PcAMT1-1 和PcAMT1-2 在豆梨中具有吸收或转运NH₄⁺的功能，并可能具备不同的调控机制。     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

1-MCP对不同成熟度粉红女士苹果贮藏生理和品质的影响

以粉红女士苹果为试材,研究了1-MCP对不同成熟度果实贮藏生理的影响。结果表明,用0.5μL/L的1-MCP在20℃下处理粉红女士苹果24h,显著降低果实在0℃贮藏期间呼吸速率、乙烯释放速率和ACC氧化酶活性,延缓果实硬度和可滴定酸含量下降。虽然不同成熟度的果实呼吸高峰和乙烯释放速率到达平台期的时间不同,但1-MCP处理对不同成熟度果实品质的影响无明显差异。SDS-PAGE分析表明粉红女士苹果在贮藏过程中出现了分子质量分别为37.1、18.0、16.6ku的3条特异性蛋白条带,1-MCP处理显著抑制特异蛋白表达,延缓特异蛋白出现的时间。     

Changes in Ripening Behaviors of 1-MCP-Treated ‘d’Anjou' Pears After Storage

Abstract

1-Methylcyclopropene (1-MCP), an ethylene action inhibitor, was applied to ‘d’Anjou' pears (Pyrus communis L.) at 20°C between 2 and 5 days after harvest. Scald of ‘d’Anjou' pears was completely controlled by 1-MCP at a concentration between 0.05 and 0.3 µl l1 after a prolonged cold storage plus 7 days of exposure to an environment with or without 500 µl l1 ethylene at a temperature of 20°C or 25°C. 1-MCP inhibited the biosyntheses of α-farnesene and its oxidative products (conjugated trienes) and thus controlled scald. However, fruit treated with the above concentrations of 1-MCP did not ripen normally in an environment with or without ethylene. Ethylene production and fruit softening of 1-MCP-treated ‘d’Anjou' pears were inhibited during 7 and 15 days at 20°C. ‘d’Anjou' fruit treated with 0.01 and 0.02 µl l¹ 1-MCP ripened normally on day 7 at 20°C after 3 months of cold storage at ? 1°C, and ripened fruit did not develop any incidence of scald. Untreated fruit developed substantial scald. After 4 months of storage or longer, both untreated fruit and fruit treated with 0.01 and 0.02 µl l 1 1-MCP developed an unacceptable incidence of scald upon ripening. Thus, use of other scald control methods may be necessary in addition to treatment with a low dosage of 1-MCP to insure both normal ripening and scald control for d'Anjou pear fruit from the Mid-Columbia district.