鸡传染性支气管炎病毒广西株N基因的克隆与序列分析

参照Gen Bank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核酸序列设计了1对引物,利用RT-PCR扩增了1个广西分离株的N基因cDNA片段,并将其克隆到p MDl8-T载体中。序列分析结果表明,N基因序列全长为1 230 bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;分离株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%;分离株与LX4株、BJ株关系较近,与疫苗株处于不同的进化分支,亲缘关系较远,是新的IBV变异株。     

IBV疫苗株基因组3‘末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗株（D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株）和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出1条特异性条带，包括部分核衣壳蛋白（N）基因以及紧接着N基因下游的基因组3‘端非编码区（UTR）。测序结果表明，从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614bp；而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406bp。序列分析发现，被检的6株IBV毒株可分为两组，其中D41、H120GD和H120SH株为一组，核苷酸序列同源性为99.7%-99.8%；而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组，其核苷酸序列同源性为99.3%-100%；两组之间的最大同源性仅为94.6%。在系统性发生进化树上，这两组分别位于不同的分支簇上，国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上。提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株。     

4株IBV中国地方分离株部分结构基因变异的研究

本研究通过RT-PCR分别获得了4个国内IBV分离株的S1、M和N基因，并进行了克隆及测序。序列分析结果表明：HaN2-95株的S1、M和N基因核苷酸序列均与IBV H120疫苗株的同源性最高；尽管HaN1-95株的S1基因与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但是该毒株的M基因和N基因却与IBV Gray株的同源性最高；GX1-98株的S1和M基因均与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但其N基因却与IBV Gray株和Ark99株有高度的同源性；GX2-98株的S1基因却与IBV Holte株的亲缘关系最近。上述结果提示国内有些IBV分离株的出现可能与疫苗株的使用有关。     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒金坛分离株核蛋白基因分析及与标准强毒株同源性比较

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus,IBV) Beau株、M41株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对引物。应用该引物 ,通过 RT- PCR扩增出 IBV金坛分离株 (JT株 )的核蛋白基因 (N基因 ) ,片段大小为 82 8bp,与设计相符。对 JT株的 N基因进行序列测定 ,并与标准毒株 KB85 2 3、CU - T2、Beau和 M41的 N基因进行同源性比较 ,结果表明 ,JT株与 KB85 2 3、CU- T2、Beau和 M41毒株的 N基因同源性分别为 87%、87%、86 %和 85 %,说明 JT株与标准毒株在 N基因上存在一定的差异。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株S1基因的克隆与序列测定

根据基因库中收录的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因的序列 ,设计了一对引物并采用RT -PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒HN99株的S1基因 ,扩增产物进行了克隆、测序 ,获得了IBVHN99株S1基因片段 ,其大小为1 739bp(含前导序列 ) ,其核苷酸序列与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte的S1基因核苷酸序列同源性较低 ,分别为 79.1 %,79.2 %,77.3%,77.8%,79 .4%,有大量的点突变并伴有基因插入和缺失 ;IBVHN99株的S1基因推导的氨基酸与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte株氨基酸的同源性分别为80 .1 %,79.9%,79.5%,78.5%,78.5%,经S1基因系统进化分析 ,提示IBVHN99株与其它各毒株的亲缘关系较远 ,初步证实IBVHN99株为一新的IBV毒株     

鸡传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异的相关性

对国内1992—2005年分离的IBV毒株的纤突蛋白(S1)和核衣壳蛋白(N)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的IBV S1和N基因的序列,对其不同毒株的S1或N基因片段和全长、S1和N基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS11.5进行同源性相关分析。结果表明:不同IBV毒株N或S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关,核苷酸r≥0.892,氨基酸0.854≤r≤0.968;但S1与N基因全长之间核苷酸的遗传变异相关性相对较低一些,而且有些毒株间S1基因同源性很低(r=0.645),但N基因同源性仍很高,显示每个基因变异的独立性。国内IBV疫苗株之间S1和N基因核苷酸高度同源(S1≥97.3%;N≥90.7%),而野毒株与疫苗株相比S1和N基因同源性均较低(S1≤84.3%;N≤87.1%),这也可能与常规疫苗对IBV野毒株不能有效保护有关。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了一对引物,通过RT-PCR特异性扩增出IBV H120疫苗株的S1基因,产物大小为1.62 kb,与设计相符.同源性比较结果显示,H120株与H52、M41和BEAU株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为97.1 %、96.9 %和96.8 %,表明IBV H120疫苗株与标准毒株的S1基因具有高度的同源性.     

国产IBV疫苗株膜蛋白基因的亲缘关系研究

利用自行设计的引物Wx和Ws，通过RT－PCR方法分别扩增出IBVD41株、H120GD株、H120SH株、H520GD株4个国产疫苗株和标准强素M41－E4株完整的M基因cDNA，然后将其分别克隆到pGMET－Easy或pMD18－T载体中。测序结果发现：这5个IBV毒株的M基因均为678bp，分别编码由225个氨基酸残基组成的多肽。序列分析表明：D41株、H120GD株和H120SH株M基因之间的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性均为100％，它们在系统发生进化树中处同一分支；而H52GD株和国内的M41－E4株和国外的M41株M基因之间的核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为99．9％和99．6％，它们之间的亲缘关系最近，在系统发生进化树上处另一个分支。     

鸡传染性支气管炎病毒M41、4/91及疫苗株Ma5、H52、H120 N基因的克隆与序列分析

参照IBVN基因序列,设计一对引物通过RT-PCR扩出IBV标准强毒株株M41,传支变异株4/91和疫苗株Ma5、H52、H120的N蛋白基因序列,基因产物大小为1.23kb。序列分析结果表明,M41株与Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为92.2%～92.9%,而经4/91与M41、Ma5、H52、H120的核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源性为91.2%～92.0%,结果表明这几个毒株N基因是相对保守的。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

Cloning and Sequence Analysis of N and M Genes of Avian Infectious Bronchitis Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of avian infectious bronchitis virus (IBV) in Guangxi province,one strain of IBV was isolated from chicken.Two pairs of primers for amplifying the N and M genes of IBV were designed according to the sequences in GenBank.The N and M genes of the strain were amplified by RT-PCR,and they were proved to be the N and M genes of IBV by cloning,sequencing and compared with reference IBV strains published in GenBank.The results showed that the N gene from the IBV isolate consisted of 1 230 bp,coding 409 amino acids.The M gene from the IBV isolate consisted of 678 bp,coding 225 amino acids.The sequence analysis of N gene showed that it shared 87.2% to 93.3% nucleotide homologies and 90.0% to 94.4% deduced amino acid sequence homologies with IBV strains from GenBank.The M gene sequence analysis showed that it shared 83.6% to 91.0% nucleotide homologies and 82.7% to 92.9% deduced amino acid sequence homologies.The phylogenetic tree analysis showed that it was closely related to BJ and LX4 strains,and were clustered into one group;But with the distant relatives from other strains of IBV.These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

鸽源冠状病毒PSH中国分离株S1基因克隆及分子进化分析

对分离鉴定的鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析.结果表明其S1基因由1 626个核苷酸组成,编码541个氨基酸,S蛋白的切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR）,与常见的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白切割识别位点相似（RRF/SRR）.该病毒与火鸡蓝冠病病毒（TCV）Gh、G1株S1基因推导的氨基酸同源性仅为24.7%、25%,而与IBV H52、H120、M41、Beau、Conn、Gray、Hotel、SH1、SH2、SH5、SH6基因推导的氨基酸同源性在75.0%～99.6%,其中与SH2、SH5的氨基酸同源性更是达到了99.6%,进一步证明该冠状病毒可能来源于IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒KIBVXJ株S1基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因,设计并合成了一对引物,经RT-PCR扩增后获得全长约为1700bp的核苷酸序列。序列分析表明,S1基因的最大开放阅读框位于12位～1685位碱基之间,编码557个氨基酸;KIBVXJ株S1基因序列在19位～292位点的氨基酸区域内有较多的氨基酸置换、插入和与缺失现象;S1的裂解位点的序列为HRRRR,具有我国地方流行株的特征。KIBVXJ株的S1基因与国内外疫苗株的同源性分析表明,核苷酸同源率为73.8%～74.2%,氨基酸同源率为74.9%～76.0%。遗传进化分析表明,KIBVXJ株与国内外的主要疫苗株亲缘关系最远,与国内近年来分离的A2株、LX4株和QXIBV株的亲缘关系最近。     

鸡传染性支气管炎病毒华南分离株核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ）核蛋白基因序列,设计并合成 １ 对引物。应用这对引物,以 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 特异性扩增出华南分离株（ Ｈ Ｎ 株）的核蛋白基因,基因产物大小为 １５ ｋｂ , 与设计相符。对 Ｈ Ｎ 株部分核蛋白基因进行序列测定,并与标准毒株 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 的核蛋白基因进行同源性比较,结果表明, Ｈ Ｎ 株与 Ｈ５２、 Ｍ ４１、 Ｂｅａｕ 和 Ｇｒａｙ 株的核酸同源性分别为 ８５％ 、８４％ ８４％ 和 ８６％ 。由此可以看出, Ｈ Ｎ 株与标准毒株在核蛋白基因上存在一定的差异。     

我国部分地区1996-2008年传染性支气管炎病毒分离株膜蛋白基因的遗传变异与系统进化分析

1996-2008年从我国不同地区分离30株传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Viruses,IBV）野毒株的M基因,采用RT-PCR方法克隆测定所分离的野毒株和澳大利亚T株的M基因序列,利用生物信息学软件与GenBank中公布的部分国内外IBV毒株的M基因序列进行比较分析,研究我国IBV的分子流行学特点和分子遗传变异规律。结果发现所测毒株M基因具有4种不同长度的开放阅读框：669bp、672bp、678bp和681bp,分别编码222、223、225和226个氨基酸的多肽,这些长度的差异是由5′端的核苷酸插入或缺失造成的。30个IBV分离株间的同源性在89．5％～100％之间。以疫苗株H120氨基酸位置为参照,在被比较的73株IBVM蛋白中发现62个位点存在变异,其中以2～5、10～16、44～46、217～222等4个区域氨基酸取代率较高。系统进化分析显示,被比较的73个IBV毒株分为5个进化群,我国的IBV分属于其中的4个群,其中第一群和第四群与我国所使用的疫苗病毒株相距较远。同时发现部分近年的分离株与10多年前分离株具有很近遗传进化关系。从M基因看,在我国出现了多种基因型IBV共存的现象,分离株与疫苗株的遗传差异提示我们需要对疫苗的选用做出重新评估。