应用双倍PCR技术快速检测大豆胞囊线虫

描述了一种基于双倍PCR技术，用种特异性引物快速鉴定大一啼胞囊线虫方法。应用两组引物扩增胞囊线虫的rDNA。第一组引物含有2个通用引物D3A和D3B，用于扩增大亚基核糖体基因（28S rDNAgene）的D3扩展区；第二组引物包括大豆胞囊线虫特异性引物GlyF1和一个通用引物rDNA2，用于扩增ITS2区的片断和部分28S基因，用此双倍PCR扩增技术检测了来自中国、俄罗斯、美国和巴西的53个大豆胞囊线虫群体，结果表明，用两组引物进行双倍PCR扩增，所有53个大豆胞囊线虫群体都产生两个明显的片断（181bp and 345 bp），其中181bp片断是SCN特异性引物GlyF1和rDNA2扩增出大豆胞囊线虫中特异性片断，在所测试的其它胞囊线虫群体，仅仅扩增出345bp的片断，而不能扩增出大豆胞囊线虫的特异性片断，用该项技术能从大豆胞囊经一虫的胞囊或单头二龄幼虫的微量DNA中，扩增出大豆胞囊线虫的特异性片断，该技术的敏感性达到单条二龄幼虫的水平。     

辽宁省大豆胞囊线虫病发生分布研究

大豆胞囊线虫病是中国大豆生产上的最重要的病害之一。本研究通过测定2006~2008年辽宁省26个地区大豆田中的大豆胞囊线虫胞囊密度,明确大豆胞囊线虫在辽宁省的发生和分布情况。在所调查的26个市(县、区)中,88%的大豆产区含有大豆胞囊线虫,平均每百克风干土中超过10个胞囊的地块占73%。其中康平县西关乡的大豆胞囊线虫胞囊密度最高,达到54.33,而开原市、东港市和桓仁满族自治县的大豆胞囊线虫胞囊密度为0,大多数地区的大豆胞囊线虫胞囊密度介于20~55之间。     

桃,梨树根际线虫研究

本文对桃树（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ Ｓｔｏｋｅｓ）、梨树（Ｐｙｒｕｓ ｓｐ．）根际线虫研究结果表明：桃树根际线虫中，寄生类占线虫总数量的９．３％，腐生类占５１．５％。捕食类占２４．８％，矛线类占１４．４％。梨树根际线虫中，寄生类８．８％，腐生类５１．６％，捕食类２２．６％，矛线类１８．０％。寄生类线虫，桃树根际线虫共鉴定出４个属，以螺旋线虫属（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）为主；梨树根际共     

大豆胞囊线虫的行为及其对环境的适应性

大豆胞囊线虫是我国大豆主产区的主要病害之一,已造成大豆产量严重损失。线虫行为学是深入研究线虫生活史和线虫与寄主植物相互关系的关键。介绍了大豆胞囊线虫的休眠、侵入、运动与迁移、取食和繁殖等方面的行为以及各种行为对环境的适应,以期从行为学和生态学角度为大豆胞囊线虫病的防治提供依据。     

一株抗大豆胞囊线虫芽孢杆菌的分离鉴定

为了筛选用作防治大豆胞囊线虫的微生态制剂的益生菌,从大豆根围土中分离芽孢杆菌Bal-7,并测定其发酵液对大豆胞囊线虫2龄幼虫活性的影响.结合形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列比对分析对菌株进行鉴定.结果表明:分离筛选的芽孢杆菌Ba1-7发酵液对大豆胞囊线虫2龄幼虫校正死亡率为83.32％,经分子生物学鉴定菌...     

黑河地区大豆胞囊线虫种群密度的研究

为了查明黑河地区大豆胞囊线虫的分布,对2010和2011年采集的黑河地区96份大豆田土样进行调查,研究了黑河地区大豆胞囊线虫的种群密度。结果表明:黑河地区采集的土样均发现大豆胞囊线虫,且其胞囊密度分布不均匀。将黑河地区各点连续2a采集得到每100g风干土中胞囊数量分为5个区段:胞囊密度为0～50个的占13.79%,胞囊密度为50～100个的占37.93%,胞囊密度为100～150个的占17.24%,胞囊密度为150～200个的占27.57%,胞囊密度超过200个的占3.45%。     

几丁质酶活性与大豆对胞囊线虫抗性的关系

为了明确几丁质酶在大豆抗大豆胞囊线虫中的作用,测定了不同抗性大豆品种被大豆胞囊线虫侵染前后以及供试诱导剂诱导被大豆胞囊线虫侵染后不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性变化。结果表明,正常生长情况下,不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性无明显差异。接种大豆胞囊线虫后,无论是抗病品种还是感病品种几丁质酶活性均增高。经过几丁质、壳聚糖和低聚糖诱导处理大豆胞囊线虫侵染的大豆后,均能在一定程度上诱导几丁质酶活性进一步增强,并随着时间的延长,酶活性表现出一定的消长趋势;与其他两个诱导剂处理相比,几丁质诱导处理大豆后几丁质酶活性高峰提前,酶活性增加幅度大。     

黄淮地区大豆胞囊线虫生理小种的抽样调查与研究

 【目的】探讨黄淮地区大豆胞囊线虫（Heterodera glycines Ichinohe）的种类及其分布。【方法】2001～2003年在黄淮大豆产区依据Riggs的鉴别模式对38个地点大豆胞囊线虫（SCN）生理小种作抽样调查，并结合文献资料，绘制出黄淮地区大豆胞囊线虫生理小种分布图。【结果】大豆胞囊线虫主要分布在山东、河北、北京、山西大部分地区、河南东部与北部、安徽北部；在山西南部及河南西南部地区的抽样调查中未检测到大豆胞囊线虫。其中1号生理小种主要分布在山东济南以南及以东地区，河南北部与河北南部交界地区，河南漯河、周口及安徽阜阳地区。4号生理小种主要分布在河南、山东、安徽交界地区，山西、北京地区，以及山东黄河三角洲地区。2号生理小种主要分布在山东聊城、德州地区，河北石家庄地区，河南焦作、获嘉地区。7号生理小种主要分布在山东半岛和河南开封、滑县、温县等地。5号生理小种在河南和河北有零星分布。另外，在河南商丘地区新发现有9号生理小种。【结论】黄淮地区的优势小种是1号和4号生理小种，抗线虫育种应该以兼抗1号和4号生理小种为主要目标。各生理小种的分布没有明显分界，优势小种分布区域中存在其他生理小种。在过去的10年中，该地区生理小种的组成相对稳定，本研究结果可供大豆抗线虫育种参考。     

Hg-rps-23基因RNAi转基因大豆对大豆胞囊线虫的抗性研究

大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,SCN)是一种极具破坏性的大豆寄生虫,一般可造成大豆减产10%~20%。利用植物介导RNAi是培育抗虫转基因植物新品种的有效手段之一。本研究从大豆胞囊线虫中获得了编码参与线虫m RNA代谢的关键基因-核糖体蛋白基因Hg-rps-23。采用农杆菌介导法将Hg-rps-23 RNA干扰片段导入Williams82中。PCR和Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段已导入受体大豆品种。病土接种鉴定结果表明,转基因大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性水平显著提高,表明利用植物介导RNAi可以有效提高大豆抗胞囊线虫水平。本研究为大豆抗胞囊线虫新材料的创制及新品种培育提供了一条新的途径。     

不同抑制性土壤真菌菌株对大豆胞囊线虫的抑制作用

利用稀释分离法,从抑制性土壤中分离获得真菌菌株,研究不同菌株对大豆胞囊线虫的抑制效果。结果表明,获得的100株真菌中有5个菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化和二龄幼虫(J2)具有抑制活性,分别是Dq012、Dq059、Dq003、Dq030和Dq101。经Dq012发酵液处理后,大豆胞囊线虫J2的校正死亡率达到80.84%,经其他4株真菌处理后校正死亡率均在70%左右。Dq012发酵液对胞囊孵化的相对抑制率达到87.69%,Dq003和Dq030发酵液对胞囊孵化的相对抑制率也在80%以上。用5个菌株的发酵液包衣处理大豆种子,能够抑制大豆胞囊线虫的繁殖,其中菌株Dq059的抑制作用最强,Dq012次之,Dq030的抑制作用最弱,抑制率分别为83.05%、80.58%和41.52%。综上所述,菌株Dq012对大豆胞囊线虫的抑制活性最高,其他4株效果接近,但Dq030对胞囊形成的抑制效果一般。     

中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中,从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体,其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)存在较大差异,因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究,以明确其种类及对豆科作物寄生性,为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样,用筛淘法分离孢囊,大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片,浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片,在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征,并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28S大亚基D2-D3区段,经序列测定,用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining(NJ)method)构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树,分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法,测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性,同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明,从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体,其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫(Heterodera sojae)的形态特征基本一致;ITS序列(MG859982)比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列(KU160510和KU160512)的同源性为99%和98%,而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81%(KY794762.1)。D2-D3序列(MG859981)与野生豆孢囊线虫(KU160511)相似度最高,为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致,江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支,节点支持率为100%,而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果,将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种。寄生性研究结果表明,在参鉴的11种豆科作物中,野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆(红豆)上侵染和繁殖,完成生活史;虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系,但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中,19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种;人工接种条件下相思豆(红豆)也是野生豆孢囊线虫的寄主,40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。     

Breeding Soybeans for Resistance to Physiological Race 4 of Cyst Nematode

Soybean cyst nematode causes serious damage to soybean production. In 1991, we started breeding studies on the resistance of soybeans to the cyst nematode. We found that near the Beijing area the dominant race of the cyst nematode was race 4. We made more than 50 combinations of cross. The best combination was Dan 8 × PI 437654 which resulted in marked segregation in plant height, pod habit, resistance to cyst nematode and maturity. We obtained many new soybean lines highly resistant to the cyst nematode through the pedigree method of selection, enlarging the number of plants of good combinations, alternative breeding in the North and in the South, and identification at an early generation. We now have released three soybean cultivars, Zhonghuang 12, Zhonghuang 13 and Zhonghuang 17 with moderate resistance to the cyst nematode in Beijing, Anhui, Tianjin and Northern China. In addition, we obtained many lines which were highly resistant to the cyst nematode.     

野生大豆内生芽孢杆菌BHL3501的鉴定及对大豆胞囊线虫的抑制作用

[目的]鉴定野生大豆内生芽孢杆菌BHL3501并研究其对大豆胞囊线虫的抑制作用。[方法]通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA分析,鉴定了从野生大豆根中分离筛选到的1株具有杀线虫活力的内生细菌BHL3501,并研究了BHL3501菌株代谢物不同倍数稀释液对大豆胞囊线虫卵孵化及2龄幼虫活力的影响。[结果]BHL3501菌株初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。其发酵原液处理24h后对大豆胞囊线虫卵孵化的相对抑制率为98.3%;10倍稀释液处理下相对抑制率为79.5%,均与无菌水对照差异显著。发酵原液处理24 h后,2龄幼虫的校正死亡率为93.1%,各稀释浓度处理均与无菌水对照差异显著。[结论]BHL3501代谢物对大豆胞囊线虫卵孵化有强烈的抑制作用,对其2龄幼虫有较强的毒杀作用。     

陕北关中地区大豆胞囊线虫生理小种鉴定及植物寄生线虫染色方法改进

物炭浓度在10~20 g·kg\+\{-1\}时较适宜,高浓度在一定程度上会抑制植株的生长发育。     

大豆胞囊线虫病的抗性机制研究

大豆胞囊线虫病是一种危害大豆的重要病害,引起大豆根系发育受阻和群体产量严重下降。为了进一步研究大豆胞囊线虫病的抗性机制,并对其进行有效的防治,综述了大豆胞囊线虫病的生理分化以及大豆胞囊线虫病的抗性基因和分子机制,对大豆胞囊线虫病抗性研究及品种选育进行了展望。     

吉林省大豆孢囊线虫病初步研究

对吉林省36个县(市)330块大豆地进行了抽样调查和分离鉴定,结果表明:34个县(市)有大豆孢囊线虫病发生,占调查总数的94％。该病在柳河、长岭、镇莱、白城和靖宇发生严重,扶余、吉林、舒兰、通榆、农安、榆树、德惠、磐石次之。按照Golden鉴定大豆孢囊线虫生理小种的方法,用五个国际上的标准鉴别寄主即Peking,PI88788,PI90763,Pickett和感病对照品种Lee对吉林省孢囊线虫发生较重的地块分得的线虫进行了生理小种鉴定,结果分析表明:吉林省大豆孢囊至少存在两个生理小种,即3号和7号小种,其中3号小种出现频率较高,是吉林省大豆孢囊线虫的优势小种。     

大豆抗孢囊线虫3号生理小种相关基因PCR检测方法的建立与应用

根据甜菜的抗线虫病基因保守序列,设计合成了4对引物,从中筛选出1对引物,对8份经抗孢囊线虫3号生理小种常规鉴定的大豆品种(6份抗病、2份感病)进行了PCR检测.结果表明,6份抗病品种出现了1条600bp的特异片段,而2份感病品种未出现任何条带.这与常规鉴定结果相一致.PCR Sothern杂交验证了所获得特异片段与抗线虫病基因的同源性,证明使用该方法检测大豆抗孢囊线虫病基因简单、快速、方便、可行.     

灰皮支黑豆GmPUB24基因的生物信息学与胞囊线虫诱导表达分析

为明确大豆U-box型E3泛素连接酶介导植物抗病性的机理,以抗胞囊线虫品种灰皮支黑豆为材料,利用RT-PCR技术克隆GmPUB24基因的蛋白质编码区序列（coding sequence,CDS）,对该基因进行生物信息学分析,并接种大豆胞囊线虫,进行诱导表达分析。结果表明,GmPUB24基因CDS总长1 254 bp,编码417个氨基酸,分子量为46.78 ku。蛋白质二级结构分析显示,GmPUB24编码的蛋白质含有α螺旋、无规则卷曲、延伸链、β折叠,α螺旋占比最高为58.9%,为亲水蛋白质且无跨膜结构域,无信号肽;蛋白质系统进化树表明,其与野生大豆亲缘性最高,亚细胞定位显示其定位于细胞质中。GmPUB24基因上游1 500 bp启动子区含有CGTCA-motif、TGACG-motif等响应抗病通路的作用元件,以及ABRE、WUN-motif、TATA-box等响应非生物胁迫的作用元件。实时荧光定量PCR（qRT-RCR）结果显示,GmPUB24在接种大豆胞囊线虫1~3 d持续上调表达,接种3 d时根部表达量为未接种线虫样本的6.14倍,表明GmPUB24基因可被大豆胞囊线虫诱导表达,可能参与大豆抵御胞囊线虫的过程。研究结果为阐明大豆U-box家族基因在抗大豆胞囊线虫病中的调控机制奠定了基础。