一种简便的热启动PCR方法扩增金荀菌nuc基因

本文采用低熔点琼脂糖包被Taq酶热启动聚合酶链式反应（PCR）扩增出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因,该法与普通PCR扩增效果无异且具有避免非特应性扩增等特点。同时研究了不同退火温度对扩增反应结果的影响,确定了51．7℃为最佳退火温度。为进一步研究热启动PCR方法提供了依据。     

食品中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

采用PCR技术特异性扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶编码基因(nuc基因),检测模拟样品中金黄色葡萄球菌。结果表明所建立的模拟食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测方法,特异性良好,敏感性可达61.76pg/μl。     

粪肠球菌ace基因缺失突变株的构建

本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。     

鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体TbdR2基因缺失株的构建

用PCR方法扩增tbdR2基因的左右臂和壮观霉素抗性基因表达盒,然后将以上3个片段组成的同源重组同源臂LSR连接到自杀性质粒pDS132上,构建得到重组自杀质粒pDS-TbdR2-LSR.再将此质粒通过接合转导的方法导入到鸭疫里默氏杆菌CH3株.用含卡那霉素和壮观霉素的TSA筛选可能的基因缺失株,并对其进行PCR鉴定,获得基因缺失株CH3△tbdR2.CH3△tbdR2稳定性检测结果表明该缺失株能够稳定存在.另外,CH3△tbdR2突变株在电镜下的细菌形态以及在TSA培养基上的菌落形态与野生株CH3相似.表明通过自杀质粒同源重组的方法获得了鸭疫里默氏杆菌CH3株TonB依赖受体TbdR2的基因缺失株CH3△tbdR2,为下一步研究TbdR2的功能奠定了基础.     

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（10^7.1TCID₅₀/0.1 mL）较原毒株（10^8.8TCID₅₀/0.1 mL）下降约10^1.7TCID₅₀/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。     

EMA-PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480 bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带.由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性.本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15 CFU/mL.     

奶牛乳房炎致病型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定

为探究引起奶牛乳房炎的耐药性致病菌,本研究针对西安地区显性乳房炎奶样中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行系统研究。采用常规细菌学鉴定法对34头（次）荷斯坦牛76个乳区152份奶样的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）进行了分离培养,共检出92株阳性菌株,检出率为60.5%;对其进行S.aureus致病基因nuc的特异性PCR检测,共检出28株含nuc基因的阳性菌株,检出率为30.4%;进一步针对MRSA耐药基因mecA进行特异性PCR扩增,共检出5株MRSA,检出率为17.9%。研究结果为MRSA耐药菌的有效检测及奶牛乳房炎的治疗提供了指导。     

鸡致病性大肠杆菌fimC基因缺失菌株的构建及生物学特性鉴定

本研究目的是研究fimC基因的功能。基于致病性大肠杆菌（APEC）Ⅰ型菌毛fimC基因的已知序列,通过PCR扩增了缺失169 bp的fimC基因片段,将其克隆到自杀载体pCVD442中,通过接合性转导将重组自杀性质粒pCVD442∷△fimC从大肠杆菌SM10λpir转到O2（Nal^R）中。根据同源重组原理构建了fimC基因缺失突变菌株O2（△fimC）。结合PCR扩增、测序结果及透射电镜观察,证明正确构建了fimC基因缺失突变株O2（△fimC）。体外生长及生化反应试验中,O2（△fimC）与亲本株存在一定差异。药敏试验中,两者无明显区别。鸡气管黏膜黏附试验及雏鸡的致病性试验表明：突变株在鸡气管黏膜上的黏附能力是亲本株的1/50,对雏鸡的致病性亦明显下降。鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimC基因缺失突变株的构建为深入探讨fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用、Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制及fimC基因缺失突变株其他生物学特性的研究奠定了物质基础。     

一种简便的热启动PCR方法扩增金葡菌nuc基因

本文采用低熔点琼脂糖包被Taq酶热启动聚合酶链式反应(PCR)扩增出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因,该法与普通PCR扩增效果无异且具有避免非特应性扩增等特点.同时研究了不同退火温度对扩增反应结果的影响,确定了51.7C为最佳退火温度.为进一步研究热启动PCR方法提供了依据.     

PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测     

猪源益生菌EP株突变株EP△asd的构建和初步应用

为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。     

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis,ER)基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1(登录号:KF644579.1)目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒(CMV+EGFP+polyA)为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示:经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价(10~(7.1)TCID_(50)/0.1 mL)较原毒株(10~(8.8)TCID_(50)/0.1 mL)下降约10~(1.7)TCID_(50)/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌CE129 Ⅵ型分泌系统主要亚单位基因hcp1、hcp2缺失株的构建与验证

为获得禽致病性大肠杆菌(APEC)CE129 Ⅵ型的hcp1、hcp2基因缺失株,本研究利用Red同源重组系统对APEC野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除,获得hcp1、hcp2基因单缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和双缺失株CE129△hcp1△hcp2。将hcp1、hcp2基因分别克隆到表达载体pBR322和pACYC184中,构建相应的基因回补株CE129△hcp1/phcp1、CE129△hcp2/phcp2和CE129△hcp1△hcp22/phcp1phcp2。通过PCR特异性检测和基因测序显示,上述突变株与回补株均成功构建,且均能够稳定遗传。上述基因缺失株和回补株的成功构建,有助于深入了解APEC CE129菌株T6SS的作用机制,为进一步研究APEC的致病机理及其防控奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因突变与环丙沙星耐药性的关系

采用药敏纸片法测定了临床分离的160株金黄色葡萄球菌对14种抗菌药物的耐药性，同时进行了MRSA的检测，并采用琼脂稀释法测定纸片法筛选出的45株金黄色葡萄球菌对环丙沙星的最低抑菌浓度（MIC）。根据金黄色葡萄球菌gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因的核苷酸序列设计引物、以筛选出的45株金黄色葡萄球菌染色体DNA为模板．对gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因片段进行PCR扩增，回收PCR产物．并与pMD18-T载体连接．转化DH5a感受态大肠杆菌．提取质粒并测序。进一步分析考查金黄色葡萄球菌gyrA、gyrB、grlA、grlB和norA基因及其启动子区突变与环丙沙星耐药性的关系。结果表明．grlA中的2个突变（位于80和84密码子）及gyrA中的2个突变（位于84和88密码子）与环丙沙星耐药性明显相关。     

兔支气管败血波氏杆菌PRN基因缺失突变株的构建及特性研究

利用自杀性质粒构建兔支气管败血波氏杆菌百日咳黏附素(PRN)缺失突变株以研究PRN在支气管败血波氏杆菌(Bb)致病机理中的作用,同时为支气管败血波氏杆菌病减毒活疫苗的研究提供理论依据.PCR扩增出PRN1(PRN上游基因)和PRN2(PRN下游基因)2个目的基因片段,运用基因重组技术将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PRN1和PRN2之间,将连接好的基因片段克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-PRN1-GM-PRN2,将其转化到宿主菌SM-10中,通过宿主菌SM-10与受体菌Bb固相滤膜交配,自杀性载体转移到受体菌,根据同源重组原理,抗性筛选得到基因缺失突变株,命名为Bb(△PRN).对突变株Bb(△PRN)与野生株WT进行了遗传稳定性、生长特性、溶血特性、细胞黏附特性、毒力、免疫保护性等比较研究.结果表明:Bb(△PRN)具有遗传稳定性;与野生株相比,突变株生长速度较慢,毒力有所下降,溶血活性及对Hep-2细胞的黏附能力没有明显变化;小鼠免疫原性试验结果显示,突变株免疫小鼠后可以产生强有力的免疫力,能够抵抗野生株的攻击.Bb(△PRN)突变株构建成功并具有良好的免疫原性,为支气管败血波氏杆菌病减毒活疫苗的研究奠定了基础.     

胸腺嘧啶依赖型金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定

本试验对由患慢性奶牛乳房炎奶样中分离出的1株疑似金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCVs)进行形态观察、金黄色葡萄球菌相关保守基因片段(nuc、nucA、16S rDNA) 多重PCR扩增鉴定、药敏试验、生理生化特性研究及补偿试验。结果显示分离出1株金黄色葡萄球菌SCVs,该菌含有金黄色葡萄球菌菌种特异性基因nuc和nucA;与金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC 25923的抑菌圈大小明显不同;菌落形态主要表现为菌落细小、生长缓慢、溶血能力下降;凝固酶活性下降;耐盐能力降低;革兰氏染色为革兰氏阳性球菌,呈葡萄状排列;补偿试验鉴定该金黄色葡萄球菌SCVs为胸腺嘧啶依赖型。结果表明成功分离鉴定出1株胸腺嘧啶依赖型金黄色葡萄球菌SCVs,为由金黄色葡萄球菌SCVs引起的奶牛慢性乳房炎的预防和控制及其致病机制的研究奠定前期基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB-1和IsrE对清远麻鸡的致病性

RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,已有研究表明存在于鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌中的2种RyhB同源物RyhB-1和IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。为研究RyhB在肠炎沙门菌致病性上的作用,以及2种同源物能否对毒力调控发挥协同作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单、双缺失株,利用表达载体pBR322和pACYC184分别构建了回补质粒并导入缺失株50336△ryhB-1,50336△isrE,50336△ryhB-1/△isrE中,获得各突变株相应的回补菌株,检测了野生株和各突变株对1日龄雏鸡半数致死量(LD50)、致死率、体内分布等致病性差异。结果发现,ryhB-1和isrE基因缺失后导致肠炎沙门菌毒力减弱,双基因缺失株毒力下降更为明显,表明2种小RNA均对肠炎沙门菌致病性具有增强作用,且二者对毒力的调控具有协同作用。     

大肠杆菌vpr基因突变株的构建及其特性鉴定

将重组自杀性质粒PYYVPR转化到含全VPR基因的E.coliMC1061感受态细胞中，利用卡那霉素抗性筛选到6个菌落，经PCR和Southern blot进一步验证，得到一个可靠的vpr同源基因突变株，即MC1061△vpr。该突变株与亲本MC1061具有相似的生长特征。噬菌体裂解试验表明，突变株对VT2噬菌体C43b不敏感，而MC1061敏感，可见大量的蚀菌斑。噬菌体溶原试验表明，MC1061和突变株MC1061△vpr对噬菌体的敏感性无差别。所有这些表明,vpr基因与VT2噬菌体的裂解性有关，可能是编码VT2噬菌体受体蛋白的基因。     

西宁市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及其肠毒素基因型分布研究

为了掌握金黄色葡萄球菌在西宁地区食品中的分布规律,了解不同来源、不同种类食品中金黄色葡萄球菌的污染状况及其5种肠毒素基因型(A、B、C、D、E)的分布状况。在西宁市地区采集108份食品样品,按食品微生物学(GB 4789.10-2010)金黄色葡萄球菌检验方法结合Baird-Parker氏鉴别培养基筛选金黄色葡萄球菌,通过对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因的PCR扩增以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对疑似菌落进行鉴定;同时利用PCR技术对金黄色葡萄球菌的5种肠毒素基因型进行分型检测。经分离及生化鉴定,从108份样品中得到60株疑似金黄色葡萄球菌、PCR方法及MALDI-TOF MS结果,确认为金黄色葡萄球菌,检出率为55. 56%;同时60株金黄色葡萄球菌分别检出A型6株、B型34株和D型2株,共检测到42株,检出率为70%,C型和E型未被检测到。表明西宁市食品中金黄色葡萄球菌的污染处于一个相对较高水平,因食品来源与种类不同,金黄色葡萄球菌的污染情况和毒素基因的分布情况也各不相同,对西宁市食品质量安全控制具有参考意义。     

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat~r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat~r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。