内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究

为了核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛耳成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因.采用胰蛋白酶消化法分离培养牛耳皮肤成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染细胞,通过G418筛选9d获得稳定转染的细胞克隆.PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对...     

肝特异性表达hNPC1L1转基因巴马小型猪的获得

利用Fu GENE6将线性化的p Liv-11-Neor/Kanr-h NPC1L1转染至小型猪胎儿成纤维细胞,G418筛选和PCR鉴定结果表明,成功获得了肝特异性表达人尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Human Niemann-Pick C1 Like 1,h NPC1L1)转基因小型猪胎儿成纤维细胞。利用体细胞核移植技术将转h NPC1L1基因小型猪胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,获得了肝特异性表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,并对转基因巴马小型猪进行了基因组水平、转录水平和表达水平检测,同时对目的基因进行了免疫组化定位分析。结果显示,目的基因特异性地表达于肝组织,并且定位于肝小叶间胆管膜上,表明已成功获得了转h NPC1L1基因巴马小型猪,从而为研究尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1 Like 1,NPC1L1)在肝中作用的分子机制提供了很好的模型动物。     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。