实时荧光RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物外壳蛋白基因(CP)的保守序列,设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒的实时荧光RT-PCR(Real time RT-PCR)检测方法.该方法利用TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现PCR扩增与检测同步进行.结果表明,实时荧光RT-PCR方法检测灵敏度比普通RT-PCR高约10倍,并且具有快速、简便、准确的优点,适合于CGMMV的快速、高效检测.     

利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因（CP基因）保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的研制

将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)制剂免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了3株分泌CGMMV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为3C9,3F7,2G10。用ELISA方法对所获得的3个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG2a,kappa链。 间接ELISA效价测定结果分别为3C9：1.024×107,3F7：2.56×106,2G10：1.28×106。此3株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的其他3种不同的CGMMV分离物发生特异性反应,而不与其他3种同属成员病毒 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)、齿瓣兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV) 发生反应。     

葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测*

从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）的葫芦植株上收取种子,通过苗期症状观察法、双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）、免疫捕获反转录PCR（IC-RT-PCR）法测定葫芦种子的带毒情况,并用生物学接种方法测定葫芦种子携带病毒的侵染活性。苗期症状观察法结果表明,199株幼苗有2株表现花叶斑驳症状,种子传毒率为1.01%;而利用DAS-ELISA和IC-RT-PCR法随机检测30粒葫芦病株种子,CGMMV检出率为100%。种子各部位携带的CGMMV接种葫芦表现典型的花叶斑驳症状,表明葫芦种子携带的CGMMV具有侵染活性。DAS-ELISA检测葫芦种子CGMMV的灵敏度为1/5120种子研磨液。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒海南分离物基因组测定与毒源分析

为分析2012年采自海南西瓜上具黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染典型症状的病毒分离物CGMMV-HaiN12的分子特征和可能来源, 以病叶总RNA为模板, 分3段进行RT-PCR扩增, 测定了该分离物基因组全长序列。结果表明CGMMV-HaiN12基因组全长为6 425 bp（GenBank登录号KC852074）, 与已报道的CGMMV分离物相比, 除5′和3′端非编码区核苷酸数目略有不同外, 编码区的基因结构完全相同。CGMMV-HaiN12全基因组序列与韩国分离物AF417242的相似性为99.6%、遗传距离为0.004, 在进化树的末端两者聚为一支。将CGMMV-HaiN12与已发布的中日韩分离物的外壳蛋白基因序列进行遗传进化分析, 所有分离物在0.000~0.027的遗传距离上聚为一支, 显示这些分离物具有高度的相关性, 而与欧洲的西班牙和俄罗斯的2个代表分离物具有较大差别。在进化树末端, CGMMV-HaiN12与3个韩国分离物（AJ245440、JF838188、AF417242）、2个我国湖南分离物（JQ715592、JQ715595）聚为一支, 表明CGMMV-HaiN12可能由韩国传入, 并且与传入我国湖南的分离物高度同源。在海南本地不进行西瓜制种的情况下, 为控制CGMMV在海南的危害应加强对进入海南的西瓜和砧木种子的检疫工作。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情处置效果的研究

通过对经焚烧深埋处理的CGMMV染疫甜瓜植株和用土壤消毒剂处理的土壤的连续取样;提取土壤和病残植株样品的RNA;经RT-PCR检测和汁液摩擦接种植株的方法,检测了带有CGMMV植株残体和土壤中病毒核酸的存在和其侵染活性。结果表明:经过通常检疫销毁的病植株残体和土壤可以检到病毒RNA,但已没有侵染活性。     

种子种苗上黄瓜绿斑驳花叶病毒IC-RT-PCR检测方法的建立及应用

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是一种检疫性植物病毒, 种传和农事操作是其主要传播途径, 因此种子和种苗的早期检测尤为重要?鉴于种子检测的特殊性及幼苗病毒含量低的特点, 本试验通过制备CGMMV单克隆抗体, 结合特异性引物, 建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒的IC-RT-PCR早期检测方法, 比较了IC-RT-PCR与DAS-ELISA和RT-PCR方法的特异性?灵敏度, 并对实际检测效果进行了评价?在操作程序上, IC-RT-PCR法与DAS-ELISA法一样简便, 但灵敏度远大于DAS-ELISA?IC-RT-PCR与RT-PCR均可检出20~25 ng种子上的病毒, 且特异性相当, 而DAS-ELISA法只可检出10 μg种子上的病毒?综上所述, IC-RT-PCR法可简便有效地应用于种子和种苗上CGMMV的检测, 为病毒防治的早期干预提供技术支撑?     

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒种子处理试验研究

为达到从种子源头控制病害流行危害的目的,本文通过应用药剂消毒、干热处理、干热处理结合药剂消毒、温汤浸种、温汤浸种结合药剂消毒等5种方法,对感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子进行种子处理试验,结果表明:干热处理结合药剂消毒最好,相对防效为100%,增产12.36%,其次是干热处理,防效为93.46%,增产11.33%;温汤浸种结合药剂消毒,防效为80.47%,增产11.00%;药剂消毒,防效为73.93%,增产9.27%;温汤浸种,防效为58.2%,增产7.21%。     

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列,筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明,优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10³ fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析,表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1～1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择,对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。     

插接与劈接嫁接西瓜对黄瓜绿斑驳花叶病毒病传播的比较

为了明确西瓜嫁接对黄瓜绿斑驳花叶病毒病传播的影响,应用插接法与劈接法中刀片、竹签2种工具分别粘毒后再嫁接西瓜进行传毒能力比较,结果为：插接法嫁接传毒能力强于劈接法嫁接,粘毒竹签的传毒能力强于粘毒刀片,最初嫁接的1、2株瓜苗最容易染毒发病。     

湖南首次检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒

 黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）自1935年首次报道^［1］以来,已广泛分布于亚洲、欧洲、南美洲的多个国家和地区,对葫芦科作物的生产造成了严重损失。CGMMV主要有两种重要的传播途径,一是带毒种子造成远距离传播,二是授粉、嫁接等农事操作造成的田间传播^［2］。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

为灵敏、快速地检测西瓜种子和果实中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV),根据该病毒的衣壳蛋白(coat protein,CP)序列设计特异性引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术,并对采集的12份不同发育期西瓜果实样品进行检测。结果表明,建立的RT-qPCR检测技术可对西瓜种子中的CGMMV含量进行精确检测,检测下限为3.35×10~2 copies/μL。采集的12份不同发育期西瓜果实样品中有10份被检测出携带CGMMV,病毒含量范围为1.00×10~4～4.80×10~6 copies/μL。随着果实发育,由CGMMV引起的果实倒瓤症状愈加明显,果实中CGMMV的积累量也明显增加。授粉后25 d西瓜果实中CGMMV的含量是授粉后10 d时的30倍,表明病毒在果实中的积累可能受生长发育期的影响且果实倒瓤症状的形成与病毒积累量呈正相关。     

应用MNP-RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

 A novel RT-PCR method integrated with Magnetic Nano Particles (MNP), MNP-RT-PCR, was set up for detection of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV). After the virus particles in crude sap were concentrated by MNP, viral RNAs were released and were detected by RT-PCR. CGMMV could be detected in as less as 10 ng watermelon leaf materials. Compared with normal RT-PCR, the method decreased the inhibitors of plant material and steps for extracting RNA, and also increased the sensitivity of RT-PCR detection in less time. The method is simple and suitable for quick detection of plant virus in a large number of samples.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)主要危害葫芦科作物,已被世界上许多国家和地区列为检疫性有害生物。CGMMV目前在我国23个省、市、区已有报道发生和危害,严重影响葫芦科作物的生产;近年来该病害在国内外呈现迅猛扩展的趋势并对生产造成危害。本文综述了防治该病害的种子处理、化学及生物防治、嫁接以及转基因等分子生物学方法;分析了CGMMV与寄主黄瓜互作研究的最新进展,对小分子RNA参与调控寄主对CGMMV病毒的防控策略提出了展望,并概述了下一代测序技术、基因编辑技术在植物新病毒的检测、鉴定以及培育抗病新品种等方面的应用。