实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein, CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。     

TaqMan探针法实时荧光定量RT-PCR检测番茄斑驳花叶病毒

番茄斑驳花叶病毒（tomato mottle mosaic virus,ToMMV）为近年来发现的一种烟草花叶病毒属新成员,是茄科作物上危害严重的主要病毒之一,近几年EPPO全球数据库报道多个国家从进境辣椒和番茄种子中截获该病毒。为防止番茄斑驳花叶病毒通过种子种苗进行传播扩散,本文根据该病毒GenBank中不同分离株外壳蛋白（coat protein,CP）基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了TaqMan探针法实时荧光定量RT-PCR检测ToMMV的方法。结果表明,本检测方法特异性强,对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）、番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,TomRSV）6种病毒均无交叉反...     

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。     

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1( Pineapple mealybug wilt associated virus-1, PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1 CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物, 建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为 y=-3.307×logx+38.18, 相关系数 r2为0.998。试验结果表明, 该方法能特异性地检测PMWaV-1, 对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应; 最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%, 是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。     

福州和成都竹花叶病毒的RT-PCR法检测

 竹花叶病毒(Bamboo mosaic virus, BaMV)是马铃薯X病毒属唯一携带有卫星RNA的成员,目前已经在巴西、美国以及中国台湾等地的竹类栽培区产生危害,严重影响竹材的经济价值,而在中国大陆还不曾有相关报道。根据GenBank上报道的BaMV和其伴随卫星RNA(satBaMV)序列以及未公布的序列分别设计了1对特异性引物,在优化RT-PCR条件的基础上,成功建立了BaMV的RT-PCR检测方法。 CpC-F/R用于扩增部分BaMV-CP序列(527 bp),SaC-F/R用于扩增satBaMV部分序列(472 bp)。把所建立的方法用于检测分别采自成都和福州的不同品种竹子病叶,结果均检测出了BaMV和satBaMV,而无症样品未得到任何产物。本研究在基因水平上为BaMV的检测提供了快速、准确、灵敏的新体系,为我国竹类栽培过程中竹花叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

兰花上凤仙花坏死斑病毒和建兰花叶病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot vjrus,INSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的保守序列设计特异性引物,建立了双重RT-PCR同时检测两种病毒的方法.用该方法对兰花基地的可疑发病兰株进行检测,结果从田间采取的12株可疑兰花中有6株检出INSV,1株检出CyMV,2株同时检出两种病毒.     

一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒方法的建立

本研究采用Trizol快速提取植物叶片总RNA，通过GeneBank设计特异性引物，并利用一步RT—PCR技术，最终建立了一套比较实用的检测ArMV的方法。该方法对于其它病毒的检测同样具有借鉴意义。     

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT-PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT-PCR试剂盒和本文实验的一步法RT-PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法.     

微滴数字RT-PCR检测南芥菜花叶病毒

为建立一种快速、灵敏、特异的定量检测南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus,ARMY)的微滴数字RT-PCR方法,根据ArMV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估.结果 表明,该数字RT-PCR检测方法的特异性好,与其他对照病毒均无交叉反应;检测灵敏度可...     

番茄褐色皱果病毒TaqMan 荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和TaqMan探针，构建了标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示，该方法特异性强，与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R²为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当，是常规RT-PCR的100倍；采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高，适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。     

苜蓿花叶病毒ELISA检测方法的建立及其在大豆病毒调查和抗性资源鉴定中的应用

苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)是一种世界性分布、宿主范围广、具有严重危害性的植物病毒,能引起大豆的严重病害。本研究利用原核表达的AMV CP蛋白制备的抗血清,建立了高效、准确的AMV间接ELISA检测方法,并应用于病害调查和抗性鉴定,结果表明制备的3份抗血清对重组蛋白和AMV感染的大豆植物粗提液的效价均达到256 000倍,血清特异性分析结果显示3份抗血清仅识别感染AMV的大豆叶片,不识别感染大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)的大豆叶片。通过建立的AMV间接ELISA与常规RT-PCR同时对采集的50份疑似感染AMV的大豆样品进行检测,有46份样品检测结果一致,符合率达92%。利用建立的AMV ELISA方法和课题组已建立的SMV ELISA方法对吉林省大豆主产区的大豆样品进行病毒检测的结果表明,病毒检出率为38.30%,SMV的检出率达30.85%,AMV的检出率达17.06%,复合侵染率为9.61%。对接种AMV的40个大豆品种进行抗性鉴定,结果显示40份大豆全部感染AMV,但是病毒载量存在差异,部分品种表现出AM...     

3种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

正病毒病是引起甘薯品质降低和减产的重要原因之一,现已报道30多种能侵染甘薯的病毒~([1,2])。山东省是甘薯种植大省,病毒种类近10种~([3,4])。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFM V)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)是为害甘薯的主要病毒,在全国甘薯种植区广泛分布~([5,6])。甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)为Potyvirus的一个暂定种,多与同属的其他病毒混合侵染~([7])。多重PCR技术由Chamberian等~([8])1988年首次提出,可实现多基因的同时扩增,具有节省时间、提高效率的优点,已初     

甘蔗花叶病毒第IV组分离物RT-PCR检测体系的建立及应用

 甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮化叶病的主要病毒。根据其基因组序列,SCMV可以分为4个组,其中第IV组分离物属于新出现的强毒株系。为了快速检测SCMV尤其是IV组分离物的发生情况,我们针对SCMV I-IV组及IV组分离物设计了6对引物,从中筛选出特异性最强的2对引物(I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R),进行PCR体系的优化。优化后的PCR体系为:退火温度51℃,dNTP终浓度为0.1 mM,引物终浓度为0.20 μM,TaqDNA聚合酶终浓度为0.015 U·μL^-1。利用该体系, 引物对I-IV-2F/I-IV-2R和IV-1F/IV-1R均能够从50 ng感病叶片或0.05 ng病毒RNA中检测出SCMV。通过优化两对引物浓度比例建立了能同时检测SCMV所有分离物及第四组分离物的双重PCR体系。利用该体系从山东、河南及云南均检测出SCMV第IV组分离物的发生。本研究为SCMV尤其是SCMV第IV组分离物的快速检测提供了技术支持。