白背飞虱两个P450基因的克隆、序列分析及杀虫剂胁迫下的表达分析

细胞色素P450属于超基因家族,与昆虫对杀虫剂抗药性产生有重要关系。本文在白背飞虱转录组数据的基础上,克隆到了两个P450基因,分别命名为SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2,其分别编码534和471个氨基酸,分子量约为61.567和53.762 kDa,理论等电点为9.18和8.74。结构域分析发现,SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2氨基酸序列中均包含5个P450基因共有序列。噻虫嗪、噻嗪酮和阿维菌素的LC₁₀、LC₂₅、LC₅₀和LC₉₀4个不同浓度处理白背飞虱3龄若虫48 h后,采用RT-qPCR技术测定SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2两个基因的相对表达量,结果表明：噻虫嗪、噻嗪酮LC₁₀和LC₂₅浓度胁迫后SfCYP4DE1基因相对表达量均显著低于对照组,但随着浓度继续的加大,SfCYP4DE1基因的表达量出现上升的趋势。不同的是,经阿维菌素LC₁₀和LC₂₅浓度胁迫后,SfCYP4DE1基因的表达量均显著高于对照组,且随着浓度增加其表达量升高。与对照组相比,经噻虫嗪不同浓度胁迫后,SfCYP353D1v2基因表达量均呈现出诱导增加的趋势,且LC₁₀、LC₅₀和LC₉₀处理组显著高于对照组。噻嗪酮LC₁₀浓度处理能够显著诱导SfCYP353D1v2基因的表达,但阿维菌素LC₁₀浓度处理下其表达量被显著抑制。另外,以阿维菌素LC₅₀和LC₉₀浓度处理后,SfCYP353D1v2基因的表达量被显著诱导。以上研究结果可为进一步研究白背飞虱P450基因对杀虫剂解毒代谢途径提供基础资料。     

棉铃虫CYP9G5基因的克隆、序列分析及溴氰菊酯胁迫表达

细胞色素P450是超基因家族,属于生物体内重要三大解毒酶系之一,参与内源物和外源物的合成与氧化代谢。本文通过棉铃虫溴氰菊酯短期胁迫转录组数据分析,克隆获得一条P450基因CYP9G5（GenBank：KM016757.1）,编码493个氨基酸,分子量约为57.930 kDa,理论等电点pI 7.16。通过实时荧光定量技术,分析CYP9G5基因在棉铃虫不同组织和溴氰菊酯处理后表达量的变化,发现CYP9G5在头部表达量最高,经过溴氰菊酯处理后CYP9G5表达量也显著升高。推测出CYP9G5极有可能参与棉铃虫对溴氰菊酯的代谢,可能对棉铃虫的耐药性有一定的作用。本研究为进一步探索棉铃虫的抗药性和新农药的开发奠定了基础。     

温度诱导对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达的影响

为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应,运用实时定量PCR法测定了不同温度对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达量的影响。结果表明:经过17、20、23、26℃诱导后,星豹蛛hsp70和hsp90基因表达量与对照组差异不显著,当高于26℃时,随着温度的升高表达量呈先升高后降低的趋势,且在38℃时最高,分别为对照组的716.46和10.44倍,差异显著;低于17℃时,表达量随着温度的降低呈逐渐升高的趋势,其中-1℃时最高,分别为对照组的334.53和9.38倍,差异显著;-1~41℃范围内,在相同诱导温度处理下,星豹蛛hsp70基因表达量显著高于hsp90基因。表明当星豹蛛受到温度高于26℃或低于17℃的刺激后,体内hsp70和hsp90基因表达量均增加,且hsp70基因表达量高于hsp90基因。说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达,从而对机体产生保护作用,且这种保护只在一定温度范围内起作用。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

腰果角盲蝽气味结合蛋白基因HtheOBP3的克隆及组织表达分析

为明确腰果角盲蝽Helopeltis theivora气味结合蛋白3(odorant binding protein 3,OBP3)功能及其嗅觉感受机制,利用PCR技术结合c DNA末端快速扩增（rapid amplification of c DNA ends,RACE）技术克隆其cDNA全长序列,利用多个生物信息学软件对其进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在腰果角盲蝽成虫不同组织中的表达量。结果显示,腰果角盲蝽HtheOBP3基因（GenBank登录号为QHI06949）开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸残基,预测蛋白分子量约为17.15 kD,等电点为5.14,无信号肽和跨膜结构,蛋白氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸残基和性信息素结合蛋白-普通气味结合蛋白（pheromone binding protein-general odorant binding protein,PBP-GOBP）家族的保守结构域。HtheOBP3蛋白具有6个α-螺旋和3对二硫键,其中5个α-螺旋形成1个结合口袋。腰...     

紫茎泽兰CYP75基因cDNA片段的克隆与鉴定

根据菊科植物P450基因CYP75 B5(GenEMBL AF313489)和C YP75 B6(GenEMBL AF313488)核酸序列同源区设计引物,用RT-PCR方法从紫茎泽兰植株中获得一大小为378bp的细胞色素P450基因片段。经克隆、测序及氨基酸序列同源性比较,发现由该片段推导出的氨基酸序列与C YP75 B5和C YP75 B6的氨基酸序列分别具有79.5%和85.6%的同源性,与C YP76 B1、C YP81 B1 v1、C YP81 E1 v2同源性分别为40.8%、35.2%、35.0%,与C YP73 A家族的同源性在28.9%～31.4%;所绘制的系谱树与同源性分析结果一致。因此,初步确定该序列为C YP75家族中某一成员的结构基因片段。     

禾谷缢管蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆和表达分析

为探讨高温驯化对禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi Hsp90基因表达量的影响,以及其在不同发育阶段的表达,通过RT-PCR与RACE技术克隆了热激蛋白Hsp90基因的全长,命名为Rp Hsp90,采用生物信息方法分析了其序列特征,利用实时荧光定量PCR技术研究了Rp Hsp90在禾谷缢管蚜不同发育阶段和驯化后热激处理的表达量变化。结果显示:禾谷缢管蚜Rp Hsp90的c DNA全长为2 644 bp,编码727个氨基酸,分子量为83.2 k D。推导的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的5个签名序列及C末端细胞质特征序列EEVD。系统进化树结果显示,Rp Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同发育阶段Rp Hsp90均有表达,并且4龄若蚜期表达量最高,显著高于其它龄期;27℃热驯化后禾谷缢管蚜Rp Hsp90表达量和常温24℃处理试虫无显著差异;热激处理显著诱导Rp Hsp90的表达,39℃热激处理Rp Hsp90表达量显著高于40℃热激处理;热驯化种群经热激处理后表达量显著高于常温热激处理。表明Rp Hsp90在禾谷缢管蚜不同龄期差异表达,且在该虫对热胁迫的响应中具有重要作用。     

除草剂对星豹蛛活动行为的影响

为明确除草剂对星豹蛛Pardosa astrigera活动行为的影响,采用药膜法测定乙氧氟草醚、乙羧氟草醚和百草枯3种常规除草剂对星豹蛛的毒力,应用旷野试验法研究除草剂对其活动行为的影响。结果表明:乙羧氟草醚对星豹蛛的LC10为6.75 g/L,乙氧氟草醚的LC10为1.09 g/L,3种除草剂对星豹蛛的毒力顺序为乙氧氟草醚乙羧氟草醚百草枯。高浓度(5.81~10.53 g/L)乙氧氟草醚处理后雄蛛的行走总路程和平均行走速度均较推荐浓度处理(0.07 g/L)显著降低,6.75 g/L乙羧氟草醚处理后雌蛛行走总路程较其余浓度处理显著降低、雄蛛最大行走速度较0.08 g/L浓度处理显著降低,但这2种除草剂各浓度处理均与对照无显著差异;80.00 g/L百草枯处理后雄蛛的行走总路程、最大行走速度和平均行走速度均较对照显著降低,分别为248.48 cm、12.03 cm/s和0.83 cm/s,4.00~20.00 g/L百草枯处理后雌蛛最大行走速度较80.00 g/L处理显著下降。5.81 g/L乙氧氟草醚处理后雄蛛行走区域数显著下降,较对照下降了4.57个,而雌蛛行走区域数则显著升高,较对照增加了2.20个。20.83 g/L乙羧氟草醚处理后雄蛛在中心区域停留时间最短,为0.48 s,占总时间的比例仅为0.16%,5.81 g/L乙氧氟草醚处理后雌蛛在中心区域停留时间最长,为15.94 s,占总时间的比例为5.31%。表明高浓度除草剂处理星豹蛛后对其活动行为影响显著,而推荐浓度处理后对其无显著影响,说明3种除草剂在推荐剂量下对星豹蛛相对安全。     

基于年龄-龄期两性生命表的星豹蛛种群生长发育和繁殖动态分析

为明确温度对星豹蛛Pardosa astrigera生长发育和繁殖的影响,在室内测定17、21、25、29和33℃温度下星豹蛛各发育阶段的发育历期和繁殖力,并构建其年龄-龄期两性生命表,利用构建的生命表分析不同温度下星豹蛛的存活率、繁殖力、寿命期望、繁殖值和种群参数。结果表明,当温度为17~33℃时,随着温度升高星豹蛛成蛛前发育历期呈先缩短后延长的趋势,当温度为25℃时,星豹蛛雌、雄成蛛前发育历期最短,分别为47.8 d和50.5 d;当温度为17、21、25、29和33℃时,星豹蛛雌成蛛第1次繁殖分别于第108天、第63天、第57天、第46天和第60天开始;在17~33℃范围内,随着温度升高,星豹蛛种群特定年龄净繁殖力先升高后降低,29℃时达到最高;在17~33℃范围内,星豹蛛的内禀增长率、周限增长率和净生殖率随温度升高呈先增加后降低的趋势,25℃时达到最大值,分别为0.04 d^-1、1.04 d^-1和9.95;在25~33℃范围内,随温度升高平均世代周期则呈先降低后增加的趋势,在25℃时出现最小值,为54.8 d。表明25℃和29℃分别是星豹蛛种群增长和繁殖的最适宜温度。     

低剂量杀虫剂对星豹蛛捕食桃蚜功能模型的影响

为明确杀虫剂对捕食性天敌蜘蛛对蚜虫控制作用的影响,采用药膜法和点滴法测定了星豹蛛Pardosa astrigera和桃蚜Myzus persicae对4种杀虫剂的敏感性,并利用HollingⅡ捕食功能反应模型分析了杀虫剂作用下星豹蛛对桃蚜的捕食功能反应。结果表明:桃蚜和星豹蛛均对阿维菌素最敏感,其对应的LD₅₀和LC₅₀最低,分别为4.94×10^-4 μg/头和0.14 mg/L;吡虫啉和啶虫脒居中,毒死蜱最低;前三者的LD₅₀依次是毒死蜱的127.47、72.05和1.67倍,LC₅₀依次是毒死蜱的261.36、3.60和4.08倍。杀虫剂处理星豹蛛后对桃蚜的功能反应类型基本符合HollingⅡ模型;除3.0、4.5 mg/L啶虫脒处理外,不同杀虫剂作用下星豹蛛对桃蚜的处理时间长于对照组的0.016 d,最大日捕食量小于对照组的60.7头;同种杀虫剂作用下,随着浓度增加平均日捕食量逐渐降低,处理时间延长,瞬间攻击率下降;寻找效应随着桃蚜密度和杀虫剂浓度的增大而下降。表明低剂量杀虫剂处理星豹蛛后延长了其对猎物的处理时间,降低了瞬间攻击率,减少了日捕食数量,从而降低了对猎物的控制作用。     

亚致死剂量氟啶虫胺腈对灰飞虱细胞色素P450的影响

为明确氟啶虫胺腈对灰飞虱Laodelphax striatellus细胞色素P450的影响,评估其抗药性风险,采用点滴法、酶活力分析法和实时荧光定量PCR法分别测定了氟啶虫胺腈对灰飞虱的毒性及对其细胞色素P450酶活力和P450基因表达量的影响。结果表明,氟啶虫胺腈对灰飞虱的致死中量LD_(50)随着虫龄的增加而升高,1~5龄若虫的LD_(50)为0.10~0.94 ng/头,雌、雄成虫的LD_(50)分别为1.09 ng/头和1.07 ng/头。氟啶虫胺腈对4龄若虫的亚致死剂量LD_(10)、LD_(30)和LD_(50)分别为0.17、0.41、0.76 ng/头,处理灰飞虱4龄若虫后可将其体内P450酶活力分别显著提高1.60、1.97和1.22倍;而各处理响应的P450基因的种类和数量不同,但相对表达量均受到诱导;CYP4DE1、CYP426A1、CYP303A1、CYP4C、CYP6FK1和CYP4C71v2的相对表达量表现出时间效应,表达量高峰在处理后24 h或48 h。表明不同亚致死剂量的氟啶虫胺腈在特定时间点可提高相应的细胞色素P450基因表达量,从而使酶蛋白量增加,可能导致灰飞虱体内细胞色素P450酶活力上升。     

从虫害诱导水稻挥发物中筛选对拟环纹豹蛛有引诱活性的化合物

为明确虫害诱导水稻挥发物中对拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata有引诱作用的活性组分,选择了10种常见虫害诱导产生的水稻挥发物,测试了拟环纹豹蛛雌、雄成蛛对每种挥发物的嗅觉选择和触角电位反应。嗅觉选择结果表明,虫害诱导产生的水稻挥发物对拟环纹豹蛛雌成蛛的嗅觉选择无诱导作用,但能诱导拟环纹豹蛛雄成蛛的嗅觉选择,其中1μg/μL和1.5μg/μL水杨酸甲酯、0.25μg/μL(Z)-3-己烯-1-醇、0.5μg/μL 2-庚酮、0.25μg/μL和1μg/μL芳樟醇对雄成蛛的诱导作用显著;拟环纹豹蛛雄成蛛对1μg/μL水杨酸甲酯、0.25μg/μL(Z)-3-己烯-1-醇、0.5μg/μL 2-庚酮及0.25μg/μL芳樟醇的选择潜伏期两两间差异均不显著。触角电位分析表明,4种挥发物同样能诱导拟环纹豹蛛雌、雄成蛛触肢和第一对步足产生电位反应,水杨酸甲酯和(Z)-3-己烯-1-醇的效果最显著,2-庚酮和芳樟醇稍弱;只有2-庚酮在雌、雄成蛛间差异显著,其它挥发物在雌、雄成蛛间均差异不显著。表明虫害诱导的水稻挥发物能诱导拟环纹豹蛛成蛛产生嗅觉选择和电位反应,不同挥发物可能代表不同的生态学信息,挥发物种类和浓度对雌、雄成蛛的影响存在差异。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。