苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达*

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定。它含有cry1Ac基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac。该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3534bp。编码蛋白分子量为133.5kD,含1177个氨基酸,等电点为4．8,与CrylAc3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同。该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133．5kD蛋白带。室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC5o值分别为19.236和3276μg／g饲料。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-21b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成,推导的分子量为81.2kD。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白,是一种新的Cry1Ia蛋白,该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明:Cry1Ia8对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50分别为0.268μg/g和2.227μg/mL,其杀虫效果与Cry1Ab和Cry1Ac相当。对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)也有较好的活性,但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲(Pyrrhalta aenescens)没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源,为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了重要依据。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa14基因的分离、克隆及其表达

Bt25是中国自行分离的对小菜蛾(Plutella xylotella)具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),经PCR-RFLP鉴定含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,以Bt25质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因。序列测定结果表明,该基因编码区为3552bp,编码1183个氨基酸,分子量为133．7kD,pI4．755。该基因序列已在GenBank注册,登记号为AY197341,并获得正式命名cry1Aa14。在氨基酸序列918～1180间,和已知的11种cry1Aa存在22-23个氨基酸的差异(其中1094～1097的4个氨基酸无对应序列),而这段区域和Cry1Ab氨基酸序列的对应区域无差异。cry1Aa14全长基因插入Bt表达载体,获得了重组表达质粒pBYB1,转化Bt无晶体突变株HD73cry-,经过抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实转化成功。SDS-PAGE分析表明,该基因在上述受体中能正常表达133kD蛋白。杀虫生物测定结果表明,cry1Aa14表达产物对小菜蛾幼虫具有显著的毒杀作用,与cry1Aa12进行比较,毒力无明显差异。这种单基因菌株的发现及其基因的获得,为害虫抗性研究和高效工程菌的构建提供了重要实验材料。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

苏云金芽孢杆菌WB9菌株cry2Ac4基因的克隆及表达

WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株,经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。根据cry2基因序列设计引物,以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。该基因在GenBank上登录号为DQ361267,被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ac4。通过亚克隆方法将cry2Ac4基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac,将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-,得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白,形成方形晶体。生物测定结果表明,cry2Ac4基因表达产物对桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)幼虫具有显著的毒杀作用,但对小菜蛾(Plutella xylostella)和致倦库蚊(Culex fatlgans)幼虫基本没有效果。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达

从对棉铃虫高毒力的苏云金芽胞杆菌２１８菌株中克隆到杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙ２１８，限制性内切酶图谱表明该基因属于ｃｒｙ１Ａｃ基因。改造了两个质粒载体，并以此将ｃｒｙ２１８基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３和苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Ｂｔｉ７８／１１中，重组菌均表达１３０ｋＤ蛋白质，对小菜蛾的杀虫率在稀释１０００倍和３０００倍时可分别达到９０％以上和８０％以上。     

苏云金芽胞杆菌cry1A基因启动子上激区不同位点突变对BtI—la …

利用苏云金芽胞杆菌ｃｒｙ１Ａ启动子上游区的不同突变体,观测对ＢｔＩ－ｌａｃＺ融合基因表达的影响。结果发现,突变上游弯曲区,导致ＢｔＩ－ｌａｃＺ在菌标８０－２１中的酶活性大幅度下降,均比未突变的上游区降低２－２．５倍。而在菌株ＨＤ１３３－５中却出现相反的结果,即上游弯曲区的突变导致ＢｔＩ－ｌａｃＺ的表达比未突变体增高。如果同时突变弯曲区和反射重复区,则ＢｔＩ－ｌａｃＺ在菌 表达增强或下降的幅度大大减     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

本研究从对鳞翅目昆虫有强毒性的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢｔ）菌株ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ－１－０２中克隆到一个３．５ｋｂ的杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙＩ－０２。全序列分析表明,该基因由３５３１ｂｐ的核苷酸组成,可编码１１７６个氨基酸组成的蛋白质,根据同源性比较,该基因被确定为ｃｒｙ１Ａａ基因。它与国外报道的Ｂｔｃｒｙ１Ａａ基因具有相似的限制性内切酶图谱,核苷酸和氨基酸序列     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

在大肠杆蓖TG1中克隆和表达苏云金芽胞杆菌cryI基因

本研究分离并提纯苏云金芽胞杆菌８０１０菌株的质粒ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶解后与ＤＩＧ标记的ｃｒｙＩ基因ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段的ＲＮＡ探针杂交，显示出分子量分别为６．５６ｋｂ和４．４ｋｂ的阳性片段。用Ｂｌａｓｓｍｉｌｋ回收４．４ｋｂ的阳性片段并与双功能载体ｐＲＩＴ５重组，转化感受态大肠杆菌ＴＧ１细胞，通过斑点杂交和快检获得含４．４ｋｂ片段的克隆株Ｔ２，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明它表达了１３０ｋＤ     

苏云金芽孢杆菌S1478—1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的＆菌株S1478～1进行了特性鉴定,研究表明S1478—1分离株菌落形态和生长特征和励参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478—1分离株与其它＆thuringiensis、B．cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99％。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478—1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5．159×10^8cfu／mL。初步显示S1478—1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR—RFLP方法鉴定S1478—1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133．3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99％同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物，以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因，插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成，推导的分子量为81.2kDa。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白，是一种新的Cry1Ia蛋白，该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明：Cry1Ia8对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、小菜蛾（Plutella xylostella）有很强的杀虫活性，LC50分别为0.268 µg/g、2.227 µg/ml，其杀虫效果与Cry1Ab、Cry1Ac相当。对大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）也有较好的活性，但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲（Pyrrhalta aenescens）没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源，为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了极为重要的依据。     

苏云金芽胞杆菌WZ-9菌株对马铃薯瓢虫的毒力及其杀虫基因的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus tbutingiensis)WZ-9是从土壤中分离的对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)的幼虫有特异杀虫活性的新菌株.实验对WZ-9菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等进行了研究.结果表明,WZ-9菌株可产生菱形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130 Kd;液体培养的生长周期是24 h,随菌株的生长培养基Ph发生较大波动,在潜伏期和稳定期,Ph变化较小,在对数生长期Ph呈先迅速下降、再缓慢回升的变化趋势;生物活性测定表明,WZ-9菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72 h校正死亡率达100%,LC50为2.95×107细胞/Ml;基因型鉴定表明,WZ-9菌株含有cry7基因,利用PCR扩增方法获得了1条总长为3 781 bp基因序列,其中包含了1个3 414 bp开放读码框,其编码蛋白由1138个氨基酸残基组成,与Cry7Ab2具有99.65%序列同源性,存在4个氨基酸差异,亲缘关系最近,被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3(登录号为BI1015188).