牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法的建立

根据胶体金免疫层析技术原理,用胶体金标记纯化的兔抗巴氏杆菌IgG-A,应用提纯的兔抗巴氏杆菌IgG-B包被硝酸纤维素膜检测线用羊抗兔IgG包被对照线,制备了检测多杀性巴氏杆菌抗原的快速检测试纸条。结果表明,研制的试纸条不与牛的其他病原的抗原反应,具有较高的特异性;该试纸条的最高检出稀释度为1∶640;该胶体金免疫层析技术与菌体检查的符合率为100%。该方法具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛出血性败血症进行普查和检疫。     

牛副结核胶体金免疫层析试纸条的研制

将提纯的牛副结核分支杆菌重组蛋白MAP0862-2154c作为硝酸纤维素膜检测线的包被抗原,兔抗羊IgG作为硝酸纤维素膜质控线的包被抗体,金标羊抗牛IgG点喷到玻璃纤维素膜上,制成用于检测牛副结核抗体胶体金免疫层析试纸条。用牛的副结核标准阳性血清与检测试纸条反应,在检测线处出现红色反应带,而滴加阴性血清的试纸条检测线处未出现反应条带,上述2种血清在质控线处均出现红色反应条带;试纸条可检出牛副结核抗体的最低抗原包被浓度为400μg/mL;试纸条不与牛结核病、牛布鲁氏菌病的阳性血清发生反应;试纸条37℃保存9d后的检验结果与4℃保存的检验结果相同。所制备的试纸条具有灵敏、特异的优点,稳定性良好;10min左右即出结果,操作简便,可用于临床诊断。     

狂犬病免疫抗体胶体金检测试纸法的建立及其应用

在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线,检测线侧贴有金标抗体玻璃纤维膜结合垫,质控线侧贴有吸水垫,其中检测线包被的是纯化的狂犬病毒抗原,质控线包被的是兔抗狂犬病毒IgG,玻璃纤维膜结合垫上喷有胶体金标记的纯化的狂犬病毒抗原。检测时,取被检测犬的少量血清,滴在该试纸条的样品孔里,经过20分钟的层析作用,观察检测线和质控线的颜色,确定犬体内是否产生了有效的保护性抗体。本方法为一步检测法,具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速、无需专门仪器设备、出结果快等特点。     

沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制与应用

本试验目的为提供一种食品中国家强制检验的沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条,并对购自超市和农贸市场的肉蛋进行检测。该试纸条由吸收垫、样品垫、偶联垫和硝酸纤维素膜等组成,包被对照线和检测线,以及喷涂于偶联垫上的金标沙门氏菌多抗组装建立。结果表明该试纸条对沙门氏菌的最低检测量为1.07×107 cfu/mL,检测时间仅需5~10min。该试纸条特异性强,重复性好,可在4℃或室温存放9个月,检测结果稳定。     

鸽Ⅰ型副粘病毒免疫胶体金诊断试剂条的灵敏性和特异性试验

为建立一种快速、简便的检测鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)的胶体金免疫层析方法,采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,胶体金用抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体标记并纯化,包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的二抗包被在NC膜上作为检测线和质控线,组装成PPMV-1快速检测条。通过对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等几种样品用试纸条进行灵敏性和特异性检测,结果表明,试剂条只能与新城疫发生交叉反应,而与上述其他样品不发生交叉反应,该试纸条的特异性强,灵敏性高。     

猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸的研制

应用酶联免疫原理和胶体金层析技术,采用特殊的生产工艺,在玻璃纤维膜包被胶体金标记PCV-2抗原,在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被PCV-2抗原和兔抗PCV-2抗体,制成猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸.当待检样品阳性时,在检测线处形成抗原抗体的免疫复合物而凝聚显色;当待检样品阴性时,检测线处不形成抗原抗体免疫复合物不显色.整个试验过程只需15 min.试纸与ELISA试剂比较,两者都具有微量、特异、准确的优点,且金标试纸独具操作方便、快速和结果直观、容易判定的优点.     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

小鼠肝炎病毒金标快速检测方法的建立

本试验旨在探讨一种能够快速、简便及特异检测MHV病毒的金标检测方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗小鼠肝炎病毒(MHV)抗体,选择优化层析条件,建立双抗体夹心模式的免疫层析法试纸条对MHV进行检测。20 nm左右的胶体金颗粒、5.05 μg为最低稳定抗体量(稳定0.5 mL胶体金)、M135层析材料、3%BSA是最佳封闭液。640 μg/mL抗体蛋白为最适检测线包被浓度,而800 μg/mL抗体蛋白为质控线最适包被浓度。此试纸条能10 min快速特异地检测出MHV抗原,阳性时检测线和质控线均显示红色,阴性时则只有质控线显示红色。结果表明,胶体金免疫层析方法能快速、特异、稳定地检测MHV抗原。     

犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价

为快速检测及诊断犬细小病毒及其引起的传染性疾病,应用胶体金免疫层析技术．采用柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金颗粒,标记抗犬细小病毒单克隆抗体CPV—F1株后包被于玻璃纤维膜作为金标垫,在硝酸纤维素膜上分别包被羊抗小鼠IgG二抗和抗犬细小病毒单克隆抗体CPV—B6株作为质控线和检测线,将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫分别粘贴于背衬板上制成犬细小病毒抗原胶体金检测试纸条。特异性试验及与血凝试验的对比结果表明,该试纸条具有良好的特异性和敏感性,与进口产品的总符合率为98％。本研究为进一步研发犬细小病毒检测试纸奠定了基础。     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。     

猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条的制备与初步应用

制备1种检测猪弓形虫血清循环抗原的免疫胶体金试纸条。利用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金溶液,标记抗弓形虫表面抗原SAG3(surface antigen 3,SAG3)单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7),用另1株抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体(Anti-A-SAG3-23)与羊抗小鼠IgG抗体分别包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线和质控线,制备并优化免疫胶体金试纸条检测条件。胶体金溶液的最适pH值为加入4μL 0.2 mol/L K2CO3时的pH值。Anti-A-SAG3-7的最适标记量为12μg。最佳NC膜为Millipore 135。T、C线抗体最佳包被质量浓度均为0.25g/L,T、C线抗体最佳包被体积均为8μL。试纸条的灵敏度达1∶160,与猪囊虫阳性血清无交叉反应。稳定性试验表明,该试纸条置于室温至少可保存1个月有效,置于4℃可保存3个月有效。对广东某地区、吉林某地区猪场的各94份猪待检血清进行检测,分别有17,10份为阳性血清,样品阳性率为18.08%,10.63%。本研究制备的胶体金试纸条具有操作简单,敏感特异等优点,适合临床基层单位对猪弓形虫病的早期诊断及流行病学调查。     

猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,在玻璃纤维膜上包被胶体金标记PCV-2抗原(cap蛋白),在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被PCV-2抗原(cap蛋白)和PCV-2单抗,制成猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸条。该试纸条与猪圆环2型抗体酶联免疫检测试剂盒对比,符合率为94.7%,整个实验过程只需15 min,与ELISA试剂盒比较,具有操作方便、快速、直观的优点。     

鸽Ⅰ型副黏病毒免疫胶体金诊断试纸条的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,胶体金用抗鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)F蛋白单克隆抗体标记并纯化,包被于玻璃纤维膜。再将纯化的抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的二抗包被在NC膜作为检测线和质控线,组装成PPMV-1快速检测试纸条,建立一种快速、简便的检测PPMV-1的胶体金免疫层析方法。结果表明,所研制PPMV-1胶体金免疫层析快速检测试纸条,准确性高,且不与鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、鸡马立克病毒等发生交叉反应;批间和批内的重复性较好;灵敏度高,试纸条可以检测血凝效价≥23的病毒液;试纸条置4℃避光密封干燥保存1年,37℃放置10 d,对其性能没有任何影响。试纸条与HA、HI试验检测方法相比,检测棉拭子的符合率为97.5%,检测病料的符合率为100%。所研制的PPMV-1试纸条在鸽Ⅰ型副黏病毒检测诊断方面具有快速、灵敏、特异、简便等特点,具有良好的开发应用前景。     

牛结核胶体金免疫层析快速诊断方法的建立及初步应用

建立一种快速检测牛结核抗体的方法,用以诊断牛结核病。根据胶体金免疫层析技术原理,用兔抗牛血清蛋白和大肠埃希菌表达的牛分支杆菌MPB70-83-ESAT-6蛋白分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获杭原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果表明,MPB70-83-ESAT-6抗原的最适包被浓度为2.5mg/mL;研制的试纸条不与牛的其他疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性;该试纸条的最高检出稀释度为1∶640;试纸条与TST的符合率为80%。该试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线（T）和质控线（C）。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。     

甲硝唑胶体金试纸条的研制

为方便药物残留的现场快速检测,利用胶体金免疫层析技术研制出了一种快速检测蜂蜜样本中甲硝唑残留的试纸条。将人工抗原与二抗包被到硝酸纤维素膜上依次作为检测线和控制线,样本中的甲硝唑与检测线上的人工抗原竞争性结合胶体金结合垫上的抗体-胶体金结合物,根据检测线和控制线的显色情况判断样本的阴阳性。实验结果显示：试纸条上人工抗原MNZ-BSA的包被量为0.5mg/mL,二抗羊抗鼠IgG的包被量为0.54 mg/mL;试纸条对于甲硝唑的检出限为1μg/kg,与4种硝基咪唑类药物有交叉反应,但甲硝唑的检出限最低;样本中添加溶液A处理并用乙酸乙酯作为提取剂,单个样本检测时间为20min。适用于甲硝唑残留的大规模现场快速检测。     

甲硝唑残留的胶体金试纸条的研制

为方便药物残留的现场快速检测,利用胶体金免疫层析技术研制出了一种快速检测蜂蜜样本中甲硝唑残留的试纸条。将人工抗原与二抗包被到硝酸纤维素膜上依次作为检测线和控制线,样本中的甲硝唑与检测线上的人工抗原竞争性结合胶体金结合垫上的抗体-胶体金结合物,根据检测线和控制线的显色情况判断样本的阴阳性。结果显示:试纸条上人工抗原MNZ-BSA的包被量为0.5 mg/m L,二抗羊抗鼠Ig G的包被量为0.54 mg/m L;试纸条对于甲硝唑的检出限为1μg/kg,与4种硝基咪唑类药物有交叉反应,但甲硝唑的检出限最低;样本中添加溶液A处理并用乙酸乙酯作为提取剂,单个样本检测时间为20 min。该方法适用于甲硝唑残留的大规模现场快速检测。     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和初步运用

目的:建立一种快速检测牛结核抗体的新方法,用以诊断牛结核病。方法:利用胶体金免疫层析技术原理,用大肠杆菌表达的牛分枝杆菌重组抗原MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果:粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为6.0;MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg;MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL;交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条。在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆茵分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。结论:快速检测牛结核抗体的胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核根除计划中具有良好的应用前景。     

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症胶体金免疫层析检测方法的建立

分离体外培养的牛源D型产气荚膜梭菌参考株菌体抗原,甲醛灭活后加弗氏佐剂免疫家兔,获得兔抗牛源D型产气荚膜梭菌多抗,并对其进行纯化,用25 nm胶体金标记多抗制备金标探针,分别以兔抗牛源D型产气荚膜梭菌IgG和羊抗兔IgG作为硝酸纤维素膜上的检测线和质控线,组装胶体金试纸条,并对试纸条的检测效果进行评价。结果显示:试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果,对D型产气荚膜梭菌抗原具有高度特异性;试纸条在4℃保存6个月,其特异性及灵敏度没有明显变化。本研究建立的牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症的现场检测及鉴别诊断。     

猪肺炎支原体抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

旨在建立猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)抗体胶体金免疫层析检测方法,从而快速地对Mhp的感染和免疫情况进行监测,预防和控制猪支原体肺炎传播。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,确定Mhp特异性抗原P46蛋白的最适标记pH和标记浓度并进行标记,作为金标液。将P46蛋白包被检测线T线,抗P46蛋白单抗包被质控线C线,组装检测试纸条。经优化,建立可同时用于Mhp血清抗体和黏膜抗体检测的胶体金免疫层析检测方法。利用该检测方法对76份临床血清样品和40份临床鼻拭子样品进行检测,并与ELISA检测结果进行比较。用该试纸条检测血清样品时,灵敏性、特异性、重复性较好,与商品化Mhp ELISA抗体检测试剂盒符合率为96.1%;该方法检测呼吸道鼻拭子样品时,存在微弱的非特异性反应,检测结果与本实验室建立的sIgAELISA检测方法符合率为87.5%。本研究成功建立了Mhp抗体胶体金免疫层析检测方法,整个过程只需10 min。检测血清样品具有较好的特异性和灵敏性,检测鼻拭子样品时特异性还有待提高。