基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化。结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕鸭∕猪∕驴=2∕1∕1∕0.5∕1∕1,退火温度为58.6℃,镁离子浓度为3 mmol∕L,各动物源性成分DNA最低检出限为0.1 ng。该方法具有特异性强、灵敏度高、简单快捷等优点,可用于肉制品中6种动物源性成分的同时检测。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

7对猪源性成分检测相关引物的特异性评测

为了评测物种鉴定PCR体系的特异性及其影响因素,实验对猪源性成分鉴定相关的7对引物就退火温度、镁离子浓度和不同Taq酶的影响进行了研究。结果表明,退火温度和镁离子浓度对PCR特异性有着重要影响,而其中2对引物优化后仍与鼠、兔、牛、羊、鸡和鸭有非特异性扩增。不同的Taq酶对引物特异性也有重要影响,本实验中r Taq酶在7对引物PCR体系中特异性最佳。通过对引物体系的优化和选择不同的Taq酶,可以有效提高特异性,减少非特异性扩增,为建立物种鉴定的PCR体系及多重PCR提供了基础。     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

猪·牛·羊源性成分实时等温扩增检测方法的建立

[目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物,通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg,牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时,掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测,可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。     

食品中绿豆成分PCR特异性检测方法的建立

针对绿豆物种特异性序列,设计了定性PCR引物,建立了绿豆源性成分检测方法,并对0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol·L~(-1)的引物浓度,52、54、56、58、60、62℃的退火温度等反应条件进行优化,对该方法的灵敏度、特异性和检出限进行了测试。结果表明,在引物浓度0.4μmol·L~(-1)、退火温度58℃条件下的扩增效果最优,绿豆的检出限可达到0.5%。该检测方法具有高度的特异性,操作方便、简单、快捷,可为食品安全的检测提供依据。     

四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法,为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因,特异性引物序列参照国家相关标准或文献,通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证,建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2,方法灵敏度为0.01 ng/μL,所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分,为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。     

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。     

猪源性成分的PCR检测技术优化研究

为确定食品和饲料中的猪源性成分,本试验优化了PCR检测猪源性成分的反应体系.试验采用20 μl的PCR反应体系,分别测定Taq DNA聚合酶为0 U、1 U、2 U、3 U时;25 m mol/L的MgCl2为0、2、4、6μl时;dNTP为0、0.1、0.2、0.4μl时,其他PCR反应因素为最大量的结果.结果表明:优化的猪源性成分PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、dNTP适宜浓度分别为2 U,2μl,0.4μl.优化后的反应体系对猪肉DNA最低检测浓度为0.04ng/μl.本研究优化出的猪源性成分PCR反应体系经二重PCR反应技术进行验证,不仅快速,简便,准确性与灵敏度高,并且经济、高效.     

烟草三类根腐类病害病原真菌多重PCR检测方法的建立

本文分别设计和验证了烟草黑胫病菌和根黑腐病菌的特异性检测引物,结合镰刀菌属通用引物,进行了烟草三类根腐类病致病菌-烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的多重PCR检测,并对影响多重PCR的退火温度、引物用量、d NTP用量、模板用量分别进行了分析。结果显示,退火温度在43?61℃范围内,烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的引物用量在0.2:0.32?0.48:0.2μmol·L~(-1),d NTP用量在0.1?0.2 mmol·L~(-1)μL/25μL反应体系中,可以经济且高效的实现对烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和镰刀菌的特异性同步检测。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

随着动物源性产品(农产品、食品和饲料)中掺假造假事件不断增多以及动物来源性疾病的传播风险逐渐加大,作为保障食品安全和维护消费者权益的高效检测手段,动物源性成分的定性和定量检测技术已成为国内外的研究热点。本研究通过比对分析8种动物的线粒体全基因组序列筛选出羊源性成分特异性的引物和探针组合进行基于实时荧光PCR技术的羊源性成分鉴定。结果表明,所研发的羊源性成分检测的引物和探针具有高度的特异性,同时具有较好的灵敏度(可检测到1 pg的DNA)。羊肉制品中羊源性定量检测试验结果说明,此方法具有较好的定量检测能力。综上所述,以此引物和探针为基础的检测方法适用于羊源性食品和农畜产品的动物源性成分检测。     

3种动物源性膜芯片检测方法的构建

斑点杂交技术具有通量高、灵敏度高、检测时间短等优点,且操作方法简单、成本较低、对试验场所和设备要求不高,是适用于广大基层机构的检验技术。目前对于膜芯片的使用和推广还不是特别广泛。本文利用膜芯片技术构建一种肉及肉制品源性食品检测方法,分别设计猪、鸡、兔3种动物的肌细胞线粒体基因的特异性引物,并对3种动物基因组进行PCR扩增,用地高辛对扩增产物进行标记作为膜芯片的标记探针,对标记后的探针进行梯度稀释,选择最适浓度探针与6种动物特异性扩增产物进行斑点杂交试验。结果表明：标记探针在浓度为1pg/μL时仍然显点,与6种动物特异性扩增产物杂交结果显示,标记探针只与对应扩增产物发生显点,不与其他扩增产物反应。说明本研究设计的标记探针灵敏度高、特异性好,可用于猪、鸡、兔3种动物源性膜芯片检测。     

四种转基因玉米多重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测4种转化体的多重PCR方法,选择进口转基因玉米最为常见的4种转化体Bt11、Bt176、MON810和MON863,利用国家标准中现行有效的转化体检测引物作为多重PCR检测体系引物,对多重PCR退火温度和引物浓度等进行优化。结果表明,多重PCR方法的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4,通过建立快速、准确、高效的多重PCR为进口转基因玉米检测提供有价值的参考。     

一种可同步检测3种外源基因的多重PCR方法

为建立一种可同步检测3种外源基因的多重PCR方法,试验选择较常见的T-CaMV 35S,P-CaMV 35S和pat这3个基因作为多重PCR检测对象,对多重PCR体系中引物浓度配比和引物退火温度进行优化。结果表明,多重PCR适宜的引物终浓度(μmol/L)配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat为0.2∶0.2∶0.2以及适宜的引物退火温度为56℃;采用优化后的反应体系对多重PCR体系灵敏度进行测试,结果显示,方法灵敏度为0.5 ng;通过利用建立的多重PCR方法对已知样品进行检测,结果表明,试验建立的多重PCR体系具有良好的可靠性。     

黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持.[方法]针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针,构建重组质粒作为阳性标准品,优化引物、探针浓度及Rox参比染料用量、退火温度等反应条件,建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.[结果]TaqMan-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00μL:Premix Ex TaqTM 10.00μL,Rox参比染料(50×)0.25μL,引物MCR-1F/MCR-1R(10μmol/L)各0.50μL,MCR-1-P探针(10μmol/L)0.50μL,重组质粒pMCR-1(模板)2.00μL,灭菌双蒸水6.25μL.扩增程序:95℃预变性20 s;95℃10 s,60℃20 s,进行40个循环.该检测方法能特异性扩增出mcr-1基因,其检测敏感性为2.85拷贝/μL,是常规PCR的100倍,组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%~1.18%,均小于1.20%.采用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果未发现有携带mcr-1基因的菌株.[结论]针对mcr-1基因建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于临床筛查mcr-1基因,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持.     

PCR检测饲料中牛源组织成分的研究

为从动物饲料中快速检测所含牛源组织成分以有效防止疯牛病传入，根据牛线粒体基因核苷酸序列设计1对引物，应用CheleX法分离饲料中牛源组织成分的DNA．对分离的DNA进行PCR扩增、基因克隆及核苷酸序列分析，并建立饲料中牛源组织成分的PCR检测方法．用建立的PCR方法对羊、猪、鸡、兔和鱼组织基因组DNA进行扩增，均无特异条带；将牛组织基因组DNA倍比稀释，分别对各个稀释度的DNA进行PCR扩增，结果表明，该方法对牛组织DNA检测的敏感度可达25．2pg／μL．用该研究建立的方法对含不同量牛肉粉的鱼粉进行检测，其最小检测量达0．05％（质量分数），整个过程约需3h．     

整合子相关元件多重PCR检测技术建立及其在弧菌中应用

为了建立一种能同时检测1类整合子、4类超级整合子和1型插入序列共同区的多重PCR检测方法,根据Gen Bank中1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的序列,应用Primer Plex 2.61设计3对特异性引物,通过改变引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行了优化。此后,评价了所建立多重PCR体系的特异性和灵敏度,并应用于222株海水养殖源弧菌中3种整合子相关元件的检测。结果显示,设计的3对引物能分别单独且特异性地扩增出569 bp、430 bp和651 bp的目的条带;当int1、intSXT和ISCR13对引物(10 pmol/μL)的体积依次为0.3μL、0.6μL和0.6μL,退火温度为50℃时,多重PCR体系能特异性地扩增出3个条带清晰、区分度良好的目的条带,方法的灵敏度达到0.02 ng/μL弧菌基因组模板DNA;利用所建立的方法对222株临床分离弧菌进行3种整合子元件检测得到的结果与文献报道的单引物检测结果一致。从上述研究结果可以看出,该多重PCR方法能快速准确地检测Int1、SXT和ISCR1,适用于整合子相关元件流行监测及整合子相关的耐药性研究。