Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一.从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定.结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达.这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据.     

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CD163受体功能域鉴定

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。研究表明CD163受体的前2个SRCR区域与PRRSV感染无关。为确定PRRSV感染细胞过程中CD163受体关键SRCR区域,构建表达野生型CD163受体和缺失不同个数SRCR区域的CD163受体突变体质粒。将质粒转染BHK-21细胞24 h后,XH-GD株PRRSV感染细胞,进行间接免疫荧光(IFA)观察。结果显示,CD163前4个SRCR重复区缺失不影响PRRSV感染,SRCR5是PRRSV感染细胞所必须。为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用及与其他受体之间相互关系提供试验基础。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

调控CD163基因表达的miRNA鉴定及其在PRRSV感染中的作用分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种危害大、控制难的猪传染性疾病。PRRSV必须通过特异性受体诱导才能入侵宿主细胞,而CD163就是其中一个关键受体。在获得靶向作用CD163基因miRNA的基础上,进一步研究发现过表达miR-181c、miR-4262可极显著抑制细胞内CD163 mRNA的表达(P0.01);且在Marc-145细胞中证实miR-181c、miR-23b、miR-4262均具有极显著抑制PRRSV增殖的功能(P0.01),其中miR-4262抑制效果最佳。3个miRNA抗PRRSV增殖的分子机制比较复杂,miR-181c、miR-4262可通过靶向抑制受体CD163发挥抗PRRSV增殖作用,而miR-23b是通过其他途径发挥作用。并首次发现miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用,但其具体的分子作用机制还有待进一步深入研究。     

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组(Tester),以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示,S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因,这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库,为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化，对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示，PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1 320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示，这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示，与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路，这些通路主要与宿主免疫有关。综上，PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变，经生物信息学分析，推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。     

抗蓝耳病shRNA转基因表达载体的构建与功能验证

将靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24 h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.试验结果表明:所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。     

猪波形蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞过程中的作用,利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明,成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体,经诱导后得到高效表达,纯化后免疫兔子产生高价血清抗体(105)。病毒阻断结果表明,猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这为以波形蛋白为基础的PRRSV受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。     

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞，构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组（Tester），以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver)，采用抑制性消减杂交方法，构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库，并使用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验，得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示，S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因，这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库，为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

重组猪α干扰素抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞增殖的初步研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPolFN-α)制剂的抑制病毒作用.结果表明:rPolFN-α稀释至1010可有效预防PRRSV感染Marc-145细胞;当rPolFN-α稀释至1010可有效抑制病毒在Marc-145细胞上的增殖.研究结果在细胞水平上明确了rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用,为进一步将rPoIFN-α应用于动物试验提供了参考.     

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力.结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5％新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长.然而在1％新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长.经过在该1％血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松.由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好.比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变.     

CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪子宫内膜内皮细胞的机制,研究了CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响。将CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞,构建稳定表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞系,用0.1 MOI的VR2332株PRRSV感染表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞,收获不同感染时间的子代病毒并测定病毒滴度。结果显示,同一时间点CD163转染细胞组的PRRSV子代病毒滴度与空载体转染细胞组无明显差异。可见,CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞无明显作用。     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc-145细胞的毒力比较

[目的]研究青海PRRSV毒株对Marc-145细胞的适应性和增殖速率以及致病性和毒力等.[方法]以PRRSV青海毒株QH08、海利和诺倍威CH-1R经典毒株、GW-HR毒株及其在Marc-145细胞上的传代毒株为研究对象,对4种毒株及其传代毒株的TCID50值和细胞病变作用(CPE)出现的时间进行比较,探讨了PRRSV青海毒株对Marc-145细胞的适应性、在Marc-145细胞内的增殖速率以及该毒株的毒力.[结果]随着PRRSV传代次数的增加,病毒在Marc-145细胞中的增殖速率加快,对细胞的适应性和毒力都增强.与其他3个毒株相比,青海株毒力最强;C PE出现的时间提前,说明病毒在Marc-145细胞中的复制周期缩短,表明不同毒株PRRSV的F10比F1在Marc-145细胞中具备更好的复制能力和致病性.[结论]4株PRRSV传代毒10个代次的TCID50总趋势为渐变上调的趋势,CPE出现的时间总体上呈逐渐缩短的趋势.     

PRRSV HN-08株的分离鉴定及其部分生物学特性研究

【目的】对2008年河南省猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)流行株进行分离鉴定,并对其生物学特性进行研究,以了解免疫猪群发病的原因。【方法】从河南省猪场采集发病猪的血清和组织,采用Marc-145细胞对其中的PRRSV进行分离及初步鉴定。应用RT-PCR法对分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行ORF5基因核苷酸及推导氨基酸序列分析,同时对分离毒株进行非免疫猪人工感染试验,确定其致病性。【结果】从发病猪组织和血清中分离到1株PRRSV(HN-08株),其可引起Marc-145细胞产生细胞病变(CPE),可在Marc-145细胞中稳定传代,能被PRRSV高免血清特异性中和;从人工感染发病猪组织和血清中均分离到PRRSV。RT-PCR得到与预期大小相符的特异片段,提交NCBI鉴定为HN-08株,属美洲型PRRSV。【结论】从河南省发病猪体内分离的HN-08株属美洲型PRRSV,对猪具有很强的致病力,可引起Marc-145细胞产生CPE,病毒滴度TCID50为105.1/mL。