鸡传染性支气管炎病毒介导的细胞内受体及抗病毒基因的表达

[目的]研究传染性支气管炎病毒对细胞模式识别受体(PRRS)及天然抗病毒基因转录的激活作用.[方法]IBV M41毒株感染DF-1细胞,应用荧光定量PCR测定细胞内受体(MDA5、LGP2、MAVS和NLRC5)和抗病毒相关基因(IRF7,IFN-a/β,NF-κB1)在禽传染性支气管炎感染过程中不同时间点的转录水平表达变化.[结果]在感染的细胞中几种细胞内受体在感染不同时间点均有不同程度的升高.IFN-α、IRF7和NF-κB1的表达在感染后显著升高,而IFN-β在感染36 h内被抑制,48 h被激活.[结论]鸡传染性支气管炎病毒体外感染DF-1细胞后能显著激活细胞内受体及抗病毒基因的表达.     

禽类抗病毒天然免疫研究取得新进展

<正>近日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队在鸡马立克氏病病毒(MDV)拮抗I型干扰素逃逸宿主天然免疫研究中取得重要进展。本研究揭示了MDV衣壳蛋白VP23通过阻断宿主细胞DNA受体信号通路拮抗IFN-β表达进而促进病毒复制的机制。     

MicroRNA-1285及其靶标DDX3X对猪塞内卡病毒感染PK-15细胞的调控作用

【目的】探究MicroRNA-1285(miR-1285)及其靶标DDX3X在猪塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞中的调控作用。【方法】利用qRT-PCR、双荧光素酶活性及Western blot等方法研究miR-1285和DDX3X对I型干扰素(IFN-β)分泌及RIG-I信号通路的作用,分析miR-1285及DDX3X对SVA 3C蛋白基因表达的影响。【结果】SVA感染PK-15细胞后,miR-1285表达量显著升高,并且miR-1285与DDX3X存在负靶向关系,二者可促进IFN-β转录及蛋白水平的表达。miR-1285通过靶向DDX3X对RIG-I信号通中的MAVS、TRAF3信号分子起调控作用。对于SVA 3C蛋白基因,DDX3X可以显著抑制其转录,并且可以逆转miR-1285所诱导的上调趋势。【结论】SVA感染PK-15细胞后,宿主miR-1285及其靶标DDX3X对IFN-β及病毒3C蛋白的表达具有调控作用,研究结果将为明确miRNAs调控SVA感染的分子机制奠定基础,并为SVA的防控和诊断提供新的科学依据。     

MAVSΔTM基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达定位

线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondria antiviral signaling protein,MAVS）在脊椎动物的抗病毒免疫反应中起着非常重要的作用。为了后续研究MAVS跨膜区氨基酸在病毒侵染宿主细胞时所发挥的作用,通过基因工程方法,构建了MAVS基因C端跨膜结构域缺失突变体（MAVSΔTM）。首先通过PCR技术扩增MAVSΔTM基因片段,通过无缝克隆技术连接到pcDNA3.0-Flag载体上,后经酶切鉴定及测序结果表明MAVSΔTM基因成功克隆到pcDNA3.0-Flag载体上,并将重组质粒定名pcDNA3.0-Flag-MAVSΔTM。将重组质粒pcDNA3.0-Flag-MAVSΔTM转染至人肾上皮细胞（HEK-293T）细胞中,利用蛋白免疫印迹实验和间接免疫荧光技术检测pcDNA3.0-Flag-MAVSΔTM的表达以及定位情况。结果显示,pcDNA3.0-Flag-MAVSΔTM在293T细胞中成功表达,并且均匀分布于细胞中。研究将为进一步研究MAVS蛋白跨膜区氨基酸的功能奠定基础。     

鸭viperin基因的克隆、表达及Viperin蛋白的抗病毒活性

Viperin蛋白是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,广泛存在于各类动物体内,在进化上高度保守。本研究以鸭外周血淋巴细胞为原材料,通过RT-PCR扩增得到viperin基因,同时构建真核表达质粒p EGFP-N1-viperin,转染至DF-1细胞,用坦布苏病毒攻击后,检测该病毒在转染质粒组和转染空载体组细胞中的增殖情况。结果表明,鸭viperin基因开放阅读框为1 092 bp,编码蛋白由363个氨基酸构成。转染结果显示,viperin基因在DF-1细胞中成功表达。坦布苏病毒攻击后,与转染空载体组相比,转染p EGFP-N1-viperin组显著抑制了坦布苏病毒在DF-1细胞中的增殖。说明鸭Viperin蛋白作为抗病毒蛋白,具有良好的抑制坦布苏病毒增殖的作用。本试验结果为鸭Viperin蛋白抗病毒生物学功能的进一步研究奠定了良好基础。     

脑心肌炎病毒VP1蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路和促进病毒体外增殖

脑心肌炎病毒是一种重要的人畜共患病病原,为了初步研究EMCV介导的天然免疫反应的分子机制,将VP1蛋白克隆至真核表达载体pCMV-HA,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达,通过ELISA和实时荧光定量PCR检测VP1过表达对IFN-β表达和RLRs信号通路相关因子,以及下游刺激基因表达的影响。结果表明,VP1蛋白可显著抑制IFN-β的表达。进一步研究发现,VP1可显著抑制EMCV引起的RLRs信号通路相关因子mRNA水平(P<0.01),并且随着VP1的表达,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响。实验数据初步表明,VP1蛋白可以通过抑制MAVS的表达,进而抑制Ⅰ型IFN基因的表达并阻断其下游信号通路发挥作用。     

PEDV M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用

【目的】研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】克隆PEDV M基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,并转染HEK-293T细胞。采用Western bloting试验检测M蛋白的表达。通过双荧光素酶报告试验检测M蛋白对SeV诱导的干扰素通路活化的影响;通过Real-time PCR分析M蛋白对SeV诱导的IFN-β及干扰素刺激基因ISG54、ISG56、RIG-I mRNA表达的影响。通过过表达试验验证上调表达M蛋白对PEDV复制的影响。【结果】克隆了676 bp的PEDV M基因,成功构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,且其可在HEK-293T细胞中表达。PEDV M蛋白可抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,且M蛋白对SeV诱导的Ⅰ型干扰素通路活化的抑制具有剂量依赖效应;M蛋白能够抑制IFN-β与干扰素诱导基因ISG52、ISG56、RIG-I mRNA的表达,并具有剂量依赖效应。过表达试验表明,M蛋白在抑制Ⅰ型干扰素信号通路激活的同时促进PEDV复制。【结论】PEDVM蛋白能够抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,并促进PEDV复制。     

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.     

TLRs信号通路和促炎症细胞因子基因在鸡胚成纤维细胞感染新城疫病毒过程中的表达分析

【目的】研究新城疫病毒对鸡胚成纤维细胞中TLRs抗病毒信号通路和促炎症相关细胞因子的诱导作用。【方法】采用分离培养的原代鸡胚成纤维细胞感染中等毒力的新城疫病毒,并在感染后的4、8、12、16、24h收集细胞,利用定量PCR检测TLRs信号通路及促炎症相关细胞因子在细胞新城疫病毒感染过程中的表达变化。【结果】结果显示,TLR3、TLR7、TLR15,及其衔接蛋白基因MYD88、TRIF,以及下游基因IFN-α、IFN-β、Mx的表达量在病毒感染后呈现出显著上调(P0.05)。同时促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量在病毒感染后也表现出显著上调(P0.05)。【结论】研究表明,在鸡胚成纤维细胞对新城疫病毒的识别过程中,由TLR3、TLR7、TLR15介导抗病毒信号通路,同时诱导产生促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,并在新城疫病毒诱导的炎症反应过程中发挥重要的作用。     

三黄鸡MAVS基因克隆及生物信息学分析

[目的]掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因的生物信息学,为MAVS基因诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础.[方法]根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR扩增三黄鸡MA VS基因,并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测.[结果]三黄鸡MAVS基因编码区(CDS)全长1926 bp,编码641个氨基酸,与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列(NP 001012911.1)比对,三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异,分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K.三黄鸡MA VS基因与原鸡的相似性最高,达99.0%;与日本鹌鹑的相似性次之,为91.0%;与斑马鱼的相似性最低,仅37.6%.三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79ku,理论等电点(pI)为5.04,属于跨膜蛋白,无信号肽序列;其二级结构中折叠占0.5%,无规则卷曲占88.7%,螺旋占10.8%.[结论]三黄鸡MA VS基因序列表现出高度的保守性,可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一.     

脑心肌炎病毒3C蛋白抑制IFN-β信号通路的研究

为了探讨脑心肌炎病毒(EMCV)非结构蛋白3C对IFN-β信号通路的影响,采用RT-PCR方法构建EMCV 3C蛋白的重组真核表达质粒pVAX1-3C,将其转染至HeLa细胞,采用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot验证其在真核细胞内的表达和分布定位情况;利用Real-time PCR方法检测HeLa细胞表达EMCV 3C蛋白后Ⅰ型干扰素(IFN)效应因子的相对表达量,并用含有双荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体检测分析3C蛋白在Ⅰ型IFN信号通路中的作用。结果表明:成功构建pVAX1-3C真核表达质粒,该重组质粒能在HeLa细胞内表达,并分布在细胞核中;pVAX1-3C重组质粒转染组细胞中Ⅰ型IFN效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的相对表达量明显低于阴性对照;在双荧光素酶试验中,用poly(I:C)刺激各处理组后进行检测,转染了pVAX1-3C的细胞中IFN-β、IRF3及PRDⅡ启动子驱动的荧光素酶的表达量明显低于阴性对照;ISRE启动子驱动的荧光素酶结果显示,用IFN-β刺激后,与阴性对照组相比,转染pVAX1-3C的细胞中ISRE启动子的活性受到抑制。结论:EMCV 3C蛋白能够下调细胞Ⅰ型IFN效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的mRNA水平,并能下调IFN-β、IRF3、PRDⅡ及ISRE启动子的活性,首次证明EMCV 3C蛋白能够抑制IFN-β信号通路。     

禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水 肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞（LMH）对病原进行分离,采用PCR、透射电镜（TEM）观察和间接免疫荧光试验（IFA）对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体（SPF）鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸（cGAS）、干扰素刺激因子（STING）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β、干扰素调节因子7（IRF7）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列（43 708 bp）;遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照（DMEM/F12处理）相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ β差异达极显著水平（P<0.01）,IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平（P<0.05）,STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。     

Wip1正调控TLR4信号介导Ⅰ型干扰素的表达

Wip1是由基因ppm1d编码的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,不仅在细胞应激反应、增殖分化中起重要作用,还参与调控炎症反应和肿瘤发生等过程。Wip1能抑制TNF-α诱导的NF-κB激活,而NF-κB又是TLR4信号通路中的重要组分,因此推测Wip1在LPS诱导的TLR4信号通路中可能起调控作用。Western印记结果显示,在Wip1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs,Mouse embryonic fibroblasts)中,TLR4信号诱导的IRF3磷酸化程度显著降低。与此相一致,实时荧光定量PCR实验揭示,受LPS刺激后,Wip1基因敲除的MEFs比野生型细胞产生更少的I型干扰素IFN-β和干扰素诱导基因(Interferon-stimulated genes,ISGs),如Mx1,Mx2和Rasd2。将野生型和磷酸酶失活的Wip1分别回补进Wip1缺失的MEFs,构建了野生型和突变体Wip1回补的细胞系进一步验证该结果。通过实时荧光定量PCR研究,发现野生型和磷酸酶失活的Wip1均能促进LPS诱导的ISGs的表达,Wip1不依赖于其磷酸酶活性来促进TLR4介导的I型干扰素反应。研究首次发现Wip1能通过增强IRF3的磷酸化来促进I型干扰素的表达,揭示了机体抵御病毒感染的新机制。     

猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测

为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。     

鸡干扰素基因刺激因子cDNA克隆及生物信息学分析

试验旨在利用RT-PCR方法扩增鸡干扰素基因刺激因子CDs区,回收产物转化DH5α感受态细胞后提取质粒送测序,并根据测序结果对其进行生物信息学预测分析。结果显示鸡干扰素基因刺激因子基因CDs区为1140bp,编码379个氨基酸。同源性比对和系统进化分析显示,鸡干扰素基因刺激因子基因与环颈雉、火鸡、盔珠鸡等禽类同源性较高。生物信息学分析结果表明干扰素基因刺激因子蛋白理论分子量为42.6kD,平均亲水指数为-0.041,无信号肽,存在1个跨膜区;干扰素基因刺激因子蛋白主要定位于内质网。α-螺旋(54.62%)是主要的二级结构。该研究成功克隆了鸡干扰素基因刺激因子基因CDs区,并利用生物信息学软件对其进行了生物信息学分析预测,试验结果为进一步探讨鸡干扰素基因刺激因子在先天免疫中的生物学功能及抗病毒作用的分子机制提供了理论依据。     

Wip1正调控TLR4信号介导Ⅰ型干扰素的表达

Wip1是由基因ppm1d编码的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,不仅在细胞应激反应、增殖分化中起重要作用,还参与调控炎症反应和肿瘤发生等过程。Wip1能抑制TNF-α诱导的NF-κB激活,而NF-κB又是TLR4信号通路中的重要组分,因此推测Wip1在LPS诱导的TLR4信号通路中可能起调控作用。Western印记结果显示,在Wip1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs,Mouse embryonic fibroblasts）中,TLR4信号诱导的IRF3磷酸化程度显著降低。与此相一致,实时荧光定量PCR实验揭示,受LPS刺激后,Wip1 基因敲除的MEFs比野生型细胞产生更少的I型干扰素IFN-β和干扰素诱导基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）, 如Mx1, Mx2和Rasd2。将野生型和磷酸酶失活的Wip1分别回补进Wip1 缺失的MEFs,构建了野生型和突变体Wip1回补的细胞系进一步验证该结果。通过实时荧光定量PCR研究,发现野生型和磷酸酶失活的Wip1均能促进LPS诱导的ISGs的表达,Wip1不依赖于其磷酸酶活性来促进TLR4介导的I型干扰素反应。研究首次发现Wip1能通过增强IRF3的磷酸化来促进I型干扰素的表达,揭示了机体抵御病毒感染的新机制。     

慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。     

连翘酯苷A对IBV感染细胞内受体和抗病毒基因表达的影响

【目的】研究连翘酯苷A体外抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作用及机理。【方法】MTT检测细胞活力,连翘酯苷A作用于IBV感染细胞36h,Quantitative Real-time PCR检测细胞内IBV N基因变化、细胞内受体(MDA5,LGP2,NLRC5)和抗病毒基因(IRF7,IFN-α,IFN-β)mRNA表达变化。【结果】连翘酯苷A作用于IBV感染细胞36h,可显著抑制细胞内IBV复制,同时显著提高细胞内受体(MDA5,LGP2,NLRC5)和抗病毒基因(IRF7,IFN-α,IFN-β)mRNA表达。【结论】连翘酯苷A具有抗IBV作用,且能激活IBV感染细胞内受体(MDA5,LGP2,NLRC5)和抗病毒基因(IRF7,IFN-α,IFN-β)。     

鸡干扰素调节因子7的分子特征及其组织表达特性分析

【目的】明确鸡干扰素调节因子7 （chIRF7）的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区（CDS）并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1）,观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒（NDV）复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d（E14d）及鸡出壳第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲（占51.12%）、α-螺旋（占26.48%）、延伸链（占16.70%）和β-转角（占5.70%）组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸［Poly （I:C）］或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】 IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。     

鸡重组α干扰素与鸡重组γ干扰素抗新城疫病毒活性研究

将鸡IFN-α和IFN-γ原核表达产物经Ni2＋-NTA亲和层析法纯化,进行SDS-PAGE分析,再将纯化并已测定浓度的鸡重组IFN-α和IFN-γ稀释到1/10倍;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗新城疫病毒活性,并利用感染病毒的鸡胚来测定鸡重组表达蛋白的抗病毒活性。结果显示,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25kU左右的蛋白条带,纯化的鸡IFN-α和IFN-γ抗新城疫病毒复制的活性分别为4.32×103 U/mg和2.65×103 U/mg;当鸡IFN-α和IFN-γ的比例为125∶1时,其联合抗新城疫病毒复制的活性最佳。抗鸡胚感染病毒活性的测定结果表明,与病毒对照组相比,IFN-α和IFN-γ及IFN-α和γ联合组,HA滴度都有明显的降低;并且从鸡胚的平均死亡时间上,联合干扰素对新城疫病毒的抑制作用更强于单个干扰素的应用。这证明了鸡IFN-α、IFN-γ及其联合干扰素对新城疫病毒的复制有明显的抑制作用。