雏鸡不同组织TLR3、TLR7和TLR21 mRNA转录水平研究

参考GenBank登录的ChTLRs基因序列设计实时定量PCR特异性引物,建立检测鸡T011样受体（ChTLR）mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR3、ChTLR7和ChTLR21在雏鸡不同器官组织中的转录水平。3种ChTLRs在脾脏、法氏囊、胸腺和各段肠道组织中均有转录。其中,ChTLR3 mRNA在肾脏、胸腺、盲肠、空肠、肝脏和十二指肠转录水平较高,在皮肤中未检测到转录;chTLR7 mRNA在脾脏、肾脏、盲肠、胸腺和十二指肠转录水平较高,在肝脏和皮肤中转录水平很低;ChTLR21 mRNA在所检测组织中均有转录,其中在脾脏转录水平最高,其次为法氏囊、胸腺和十二指肠。结果表明,ChTLRs mRNA在雏鸡各器官组织中转录水平差异较大,可能与雏鸡各器官组织对病原的识别和抵抗能力有关。     

蒙古马不同组织器官TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA转录水平研究

根据GenBank中马Toll样受体基因序列设计特异性引物,建立检测马Toll样受体（TLRs）mRNA转录水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,检测TLR4、TLR2、TLR1和TLR6在蒙古马不同组织器官中的转录水平。4种TLRs在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、空肠、盲肠和骨髓中均有转录。其中,TLR4mRNA除在空肠和肝脏外,在其他组织器官中的表达水平均高于TLR2、TLR1、TLR6。免疫器官中,TLR4、TLR1mRNA在骨髓中表达量高于脾脏,而TLR2、TLR6mRNA在脾脏中表达量高于骨髓。各肠段,TLR4、TLR2、TLR1、TLR6mRNA表达水平之间在空肠的差异不是很大,而在十二指肠和盲肠中差异很大。结果表明,TLRs mRNA在马各组织器官转录水平差异较大,可能与其对病原体的识别和抵抗能力有关。     

禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

为分析禽呼肠病毒(ARV)标准毒株S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后对相关鸡Toll样受体(ChTLRs)mRNA转录水平的影响作用,利用实时荧光定量PCR,测定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV结构蛋白σC和ChTLRs的mRNA转录水平变化情况。结果表明,ARV-S1133感染CEF 10h后,ARVσC蛋白的mRNA相对表达量开始迅速上升,在48h达到峰值;同时,感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21mRNA表达量发生显著变化,在感染72h内各个受体的mRNA表达量呈波浪式变化。5个不同滴度的ARV感染CEF 24 h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述结果表明,ARV感染后可诱导CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化,可能与禽呼肠病毒的复制和致病机制相关。     

荧光定量RT-PCR检测雏鸡感染NDV强毒后胸腺和法氏囊中TLR2与TLR4 mRNA的表达

Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)在识别病原微生物过程中发挥重要作用。为了定量检测TLR2、TLR4 mRNA表达水平,研究病原与机体的相互作用,本研究建立了检测鸡TLR2、TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法,检测了新城疫病毒强毒(vNDV)感染SPF雏鸡后36h、48h时胸腺、法氏囊中TLR2、TLR4 mRNA表达量变化。结果显示该方法特异性好,RRT-PCR产物分别在85.5℃、83.3℃出现单特异峰,对TLR2、TLR4的扩增效率分别为105.91%和95.30%,相关系数分别为0.9980、0.9996,最低检测限分别为108拷贝/反应和461拷贝/反应。感染后36h vNDV显著抑制TLR2、TLR4基因在法氏囊、胸腺中的表达;感染后48h时,法氏囊、胸腺中TLR2基因的表达水平显著升高,胸腺中TLR4基因的表达显著升高,而法氏囊中TLR4基因的表达仍处于抑制状态。本研究证明TLR2和TLR4参与了鸡体对NDV的感染应答。     

金定鸭不同组织和血液中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5的表达差异分析

试验旨在研究不同Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）在鸭不同组织中的表达情况,选取300日龄雄性金定鸭10只,解剖后采集其血液及脾脏、肝脏、睾丸、肺脏、下丘脑、垂体、皮肤、腿肌、心脏、肾脏、胸肌、盲肠、小肠、胸腺,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,并用实时荧光定量PCR法检测TLR1、TLR2、TLR4、TLR5在不同组织中的相对表达情况。结果显示,各基因扩增产物的熔解曲线均有一特异性的单峰,无其他杂峰,说明引物的特异性较强,可以准确定量。4种目的基因与内参基因的扩增效率在101.4%~105.0%之间,均接近100%,相关系数（R²）为0.98~1.000。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 4种TLRs在金定鸭不同组织和血液中均有表达,但每种TLR受体在各组织中表达水平略有差异,其中TLR1在下丘脑中表达量最低,在胸肌中最高;TLR2在小肠中的表达量最低,在肺脏中最高;TLR4、TLR5在睾丸中的表达量最低,在皮肤中最高。以上结果说明,鸭TLRs在多种组织中能够广泛表达,本试验结果可为TLRs在鸭源感染过程中的作用机理研究提供科学依据。     

禽呼肠孤病毒感染后SPF鸡关节中Toll样受体的mRNA转录水平变化

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)感染主要引起鸡的病毒性关节炎和免疫抑制等,造成养禽业巨大经济损失。近年来Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)在病原体感染中的作用受到广泛关注。在本试验中,将ARV S1133毒株经足垫注射,接种7日龄SPF鸡,感染后1、3、5、7、14、21、28和35d采集鸡关节样品,利用荧光定量PCR方法检测TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21在关节组织中的mRNA表达水平变化,探讨ARV感染对鸡关节中上述TLRs mRNA表达量的影响。结果表明,ARV可引起,尤其感染早期鸡只出现足垫肿胀的症状,并且关节中这些TLRs在感染后3d显著上调并达到峰值(P<0.05或P<0.01),随后表达量开始下调,在感染后14d表达量显著下调到最低值(P<0.05或P<0.01),然后直至试验结束,恢复至与对照组基本持平。以上结果提示TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21可能参与了ARV感染对鸡关节的炎症过程,本试验结果为进一步阐明禽呼肠孤病毒的致病机理提供了依据。     

Nalp3 MDA5和TLR7受体在青年鸡组织中的表达水平

天然免疫受体在机体抗病毒过程中发挥着重要作用。为了解Nalp3、MDA5和TLR7受体在青年鸡组织中分布特征,首先应用RT-PCR方法从18周龄鸡肝脏中分别扩增目的片段,建立实时荧光相对定量RT-PCR检测多种组织中Nalp3、MDA5和TLR7受体的表达谱及相对含量。结果表明,3种受体在不同组织中转录水平差异较大,其中Nalp3在肝脏和肾脏、TLR7在心、脾和肺脏中表达量相对较高,而MDA5在各组织中表达均较低。该3种受体在不同组织中转录水平的差异提示其识别的相对作用可能不同。     

产后1周胎衣不下奶牛子宫内膜TLR2、TLR4和CD14的mRNA表达变化

为了探讨奶牛胎衣不下对子宫内膜先天免疫相关基因表达的影响,在产后第1天和第7天,对9头胎衣不下的奶牛和10头正常分娩的奶牛进行子宫内膜活检;每周收集子宫内容物进行需氧菌分离培养;在产后第1天和第7天,检测所有奶牛子宫内膜TLR1/6、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、NOD1、NOD2、CD14和MD2的基因表达。结果表明:无论奶牛有无胎衣不下,在产后21 d内大肠杆菌是子宫内容物中最常见的细菌;产后第7天与第1天相比,胎衣不下的奶牛子宫内膜TLR2、TLR4和CD14的基因表达水平明显降低(P0.05),而正常分娩的奶牛在相同时间段上述受体基因表达无明显差异,说明产后1周胎衣不下的奶牛子宫内膜TLR2、TLR4和CD14的基因表达减少可能与子宫感染炎症有关。     

禽传染性喉气管炎病毒体内外感染模型中鸡Toll样受体21mRNA转录水平的研究

为研究病毒与机体的相互作用,本研究参考GenBank中鸡Toll样受体21 (ChTLR21)的基因序列设计实时定量PCR特异性引物,以鸡核糖体蛋白L4 (RPL4)为内参基因,建立检测ChTLR21 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR21在禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中和感染SPF雏鸡免疫器官脾脏、法氏囊和胸腺组织中的转录水平.结果显示:ILTV感染CEF后2h、4h、8h和18h时间点ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照细胞的1 540.53、0.98、1.19和3.70倍.但仅在ILTV感染2h时引起ChTLR21转录水平升高,与对照组相比差异显著(P＜0.05).ILTV感染SPF雏鸡后6h、24 h和30 h脾脏中ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照的56.34、59.85和3.61倍;法氏囊中分别为0.03、25.98和3.08倍;胸腺中分别为2.52、50和7.32倍.在感染初期,脾脏中ChTLR21转录量显著升高,随后有所降低,但均高于未感染对照(p＜0.05);法氏囊中仅在感染6h时呈显著抑制(p＜0.01);胸腺中呈波动性转录水平升高,但与对照组无统计学差异(p＞0.05).本研究证明ChTLR21参与了鸡体对ILTV感染的应答,并在体内外感染模型中呈现不同的表达规律.     

荧光定量PCR检测新生犊牛胰高血糖素受体mRNA的组织分布

采用荧光定量PCR的方法,检测新生犊牛中枢和外周组织中胰高血糖受体(glucagon receptor,LNR)mRNA的基因表达.研究结果表明,NR基因在大脑皮质、小脑皮质、下丘脑、垂体、主动脉、颈静脉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾皮质、胰脏、半腱肌、皮下脂肪、瘤胃、瓣胃、网胃、皱胃、十二指肠、结肠、回肠、盲肠、直肠都有表达.垂体、下丘脑、肝脏、主动脉、皮下脂肪、小脑皮质、大脑皮质、肾皮质、肺脏中GLNR表达量高于其他组织.GLNR基因在组织中广泛分布说明了其功能的重要性.     

相对定量Real-time PCR分析不同品种鸡胚H-FABP基因表达的差异

选用孵化5d的9只莱芜黑鸡,9只汶上芦花鸡和8只济宁百日鸡胚以及孵化11d的12只莱芜黑鸡,11只汶上芦花鸡和9只济宁百日鸡胚作为研究对象,采用相对定量Real-timePCR的方法,研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因在不同品种鸡胚中表达的差异。结果显示检测的3个品种孵化11d的鸡胚中H-FABP基因的表达高于孵化5d的鸡胚。其中莱芜黑鸡的H-FABP基因的表达量变化最小,孵化11d的表达量约为孵化5d的2.64倍;变化最大的是济宁百日鸡,孵化11d的表达量约为孵化5d的4.17倍;汶上芦花鸡H-FABP基因在孵化11d的表达量约为孵化5d表达量的2.96倍。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NL-RP3.以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线.通过反应条件...     

用实时荧光定量PCR技术检测奶牛瘤胃纤维降解菌相对定量方法的研究

为了选择适合反刍动物瘤胃纤维降解菌的实时定量PCR相对定量方法,选用三头安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,针对奶牛瘤胃主要纤维降解菌,使用三种实时荧光定量PCR相对定量方法进行比较研究。结果表明：在相同条件下,对于同一个菌株基因的相对定量结果来说,SCF法和Pfaffl,M.W.法检测奶牛瘤胃主要纤维降解菌有很好的相关性（R=0.96～0.99,P〈0.05）;三种方法比较结果显示,SCF法省略了制作标准曲线等一系列试验操作过程,具有准确率高、快速和定量效果较好等特点。     

实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

茎环RT-PCR检测马立克氏病毒感染鸡相关miRNA方法的建立

本研究旨在建立一种检测马立克氏病毒人工感染鸡相关miRNA表达变化的RT-PCR方法,探讨该方法在miRNA定量检测方面的应用价值.试验选择6个具有典型肿瘤结节的马立克氏病毒感染脾脏样品作为研究材料,同时采用6个正常鸡的脾脏样品作为对照材料.利用特异的茎环反转录引物以及miRNA上下游引物对gga-miR-181a进行基于SYBRGreen Ⅰ的荧光定量PCR检测,并以U6为内参基因、2<'-ΔΔα>法检测gga-miR-181a的相对表达量.结果,在马立克氏病毒人工感染鸡的脾脏和正常鸡的脾脏中成功检测出gga-miR-181a-1的表达.证明茎环RT-PCR法能用于检测马立克氏病毒人工感染鸡的相关miRNA,并具有准确、快速、节约成本的优点.     

Screening of Reference Genes for Gene Expression in Layer Hens Tissues Using Real-time Quantitative PCR

To screen the reference genes of stable expression in different tissues of Hy-line layer (Gallus domesticus), RPS2, β-actin, GAPDH and HMBS genes were chosen as candidate gene, the software of geNorm, NormFinder and the Ct value were employed to analyze their stability in eight tissues (heart, liver, lung, kidney, duodenum, tibia, pancreas and uterus) of 120 days of age layers using Real-time quantitative PCR technology. The results showed that RPS2 gene was always dominant stability by the analysis of Ct value and geNorm software, the β-actin gene was followed; The NormFinder software showed that the HMBS gene was relative stability, and HMBS and RPS2 genes were the optimal combination; When analyzed the expression of constant reference gene in different tissues, it found that the most stable reference gene in different tissues was not the same. Therefore, it concluded that different tissues had different optimal gene, but they had the common potential, RPS2 and β-actin genes had the relative expression stability comparing the other gene.     

实时荧光定量PCR研究蛋鸡组织基因表达的内参基因筛选

为筛选出蛋鸡不同组织中稳定表达的内参基因,试验以120日龄的海兰灰蛋鸡（Gallus domesticus）为试验动物,选取常见内参基因RPS2、β-actin、GAPDH和HMBS作为候选基因,利用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对4个候选内参基因的相对表达进行测定,利用独立评价软件geNorm和NormFinder对蛋鸡的4个候选内参基因在不同组织（心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肠、胫骨、胰脏和子宫）中的表达稳定性进行评价。结果显示,Ct值分析和geNorm程序分析均得出相似的结果,即RPS2基因始终占主导地位,稳定性最强,β-actin基因次之;NormFinder软件分析显示,HMBS基因稳定性最好,最佳组合为HMBS和RPS2基因;当分析不同组织中表达恒定的内参基因时,发现不同组织最稳定的内参基因也不完全相同。由此说明,不同的组织器官和不同的分析方法得出的结论虽然不完全一致,但它们却有着一定的潜在共性,发展趋势有一定相似性,即RPS2和β-actin基因相对稳定性更强。     

鸡宿主限制因子SAMHD1实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测chSAMHD1表达量的方法,本研究以SPF鸡外周血单个核细胞总cDNA为模板,构建了包含chSAMHD1全长CDS的重组质粒pMD-chSAMHD1。跨chSAMHD1内含子设计1对荧光定量PCR特异性引物,以构建的重组质粒作为标准品,建立chSAMHD1实时荧光定量PCR检测方法,并对其敏感性、特异性及重复性进行验证,将其应用于1日龄SPF鸡组织chSAMHD1表达量的检测。结果显示:用建立的实时荧光定量PCR方法对5×10^8~5×10^4拷贝/μL的标准质粒进行检测,所得标准曲线呈现良好的线性关系;最低检测限为50拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的100倍;特异性良好,仅能检测到鸡源细胞中SAMHD1基因;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;应用该方法检测1日龄正常SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、神经、胸腺、法氏囊、十二指肠、腿肌、腺胃等组织的chSAMHD1基因拷贝数,结果显示chSAMHD1具有广泛的组织分布性。本研究为chSAMHD1功能研究提供了一种准确、有效的检测手段。