用 Digoxigenin 标记核酸探针检测 EDS-76 病毒核酸的研究

用ＥＤＳ７６病毒标准ＡＶ１２７株和分离株（Ｂ９６株）感染鸭胚,提取病毒核酸,分别经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切,获得图形和大小相似的酶切片段。分别进行ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ单酶切,也得到相似结果。病毒ＤＮＡ经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切后,与ＰＵＣ１９质粒载体重组,并转化到ＥｃｏｌｉＪＭ１０１中,筛选出一个插入片段（Ｇ片段）约为２７ｋｂ的重组质粒。用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｍｉｎ标记ＥＤＳ７６ＤＮＡＧ片段（ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切片段）及含该片段的重组质粒分别制备探针,对ＥＤＳ７６病毒ＤＮＡ进行斑点杂交,两种探针均为阳性,而对照组ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ正常鸭胚尿囊液的核酸为阴性。且后一种探针的敏感性高于前者,它的ＤＮＡ检出限量为４ｐｇ水平。结果表明,两种探针具有高度的特异性、敏感性。     

用Digoxigenin标记核酸探针检测EDS—76病毒核酸的研究

用ＥＤＳ－７６病毒标准ＡＶ１２７株和分离株感染鸭胚,提取病毒核酸,分别经ＥｃｏＲ１和Ｐｓｔ１双酶切,获得图形和大小相似的酶切片段。分别进行了ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ单酶切,也得到相似结果。病毒ＤＮＡ经ＥｃｏＲｌ和Ｐｓｔｌ双酶切后,与ＰＵＣ１９质粒载体重组,并转化到ＥｃｌｉＪＭ１０１中,筛选出一个插入片段约为２．７ｋｂ的重组质粒。     

新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与酶切分析

为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

生长激素释放因子（GRF）的基因改造及化学合成

为了提高生长激素释放因子（ＧＲＦ）的体内活性,根据猪ＧＲＦ的天然序列,设计了改造后ＧＲＦ（１～３２）的基因序列（含信号肽）,两端加设ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ的粘性末端,分４段由ＤＮＡ合成仪合成,每段长度分别为９５、９７、８６、１０６ＮＴ,２条链间有１５个碱基的粘端。用尿素变性ＰＡＧＥ纯化合成片段,用Ｔ４多核苷酸激酶对合成ＤＮＡ磷酸化,混合４个片段复性,然后用Ｔ４连接酶连接。提取ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ质粒,用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ在Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅｂｕｆｅｒ中酶切完全后,琼脂糖电泳,由ＧｅｎｅＥｌｕｔｅＡｇｒｏｓｅＳｐｉｎＣｏｌｕｍｓ回收酶切大片段。将该酶切片段与上述合成的ＧＲＦ基因由Ｔ４连接酶连接,并转化至氯化钙致敏的ＤＨ５α。选取重组菌落,提取质粒,用ＰＣＲ及双酶切鉴定阳性克隆。用Ｍｉｎｉｐｒｅｐ提取重组质粒,ＡＢＩ３７３自动测序仪测序。测序结果表明已克隆到合成的ＧＲＦ基因。     

产蛋下降综合征（EDS—76）病毒DNA酶切图谱分析

选Ｅｃｏ，Ｒｉ，Ｐｓｔ，Ｉ，Ｐｖｕ ＩＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂｇ１Ｉｔ和Ｂｇ１ＩＩＩ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株子ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４，８，１０，１０，６和７条。各酶切图形，片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和Ｐｓｔ－Ｉ－Ｅｃ     

2型犬腺病毒DNA不同酶酶切片段E3区定位研究

从２型犬腺病毒的ＭＤＣＫ细胞培养物中提取线状双链病毒基因组ＤＮＡ，利用限制性内切酶ＰｓｔＩ、ＢｇｌⅠ和ＨｉｎｄⅢ分别进行酶切，在１％琼脂糖凝胶上电泳，随后Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹到尼龙膜上，利用Ｄｉｇｏｘｉｎ标记的２型犬腺病毒Ｅ３区ＰＣＲ产物与膜上ＤＮＡ杂交，结果发现，Ｅ３区探针分别与病毒ＤＮＡ的ＰｓｔＩＢ片段、ＢｇｌＩＡｌ片段和ＨｉｎｄⅢＡ２、Ｂ２片段呈现阳性杂交反应，该结果为Ｅ３区的克隆及犬腺病毒     

筛选家蚕分子标记的有效方法—SADF法

从家蚕品种 Ｃ１０８ 和大造后部丝腺提取的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 用 Ｐｓｔ Ⅰ酶解后与自行设计的人工接头相连，并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增（ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ） 。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示，用 Ｓ Ａ Ｄ Ｆ 法在两品种中能检测到稳定的 Ｄ Ｎ Ａ 多态性片段，表明此方法可用于分子标记的筛选。经研究发现：当 Ｐ Ｃ Ｒ 反应体系中 Ｍｇ２ ＋ 为１５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ，ｄ Ｎ Ｔ Ｐｓ 为２００μｍ ｏｌ／ Ｌ，引物为１μｍ ｏｌ／ Ｌ 时可得到较好的结果；在热循环过程中，以５６ ℃退火为宜；扩增反应对模板 Ｄ Ｎ Ａ 质的要求远胜于量。     

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA酶切图谱分析

选用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅠ和ＢｇｌⅡ６种限制性内切酶，对国内４株ＥＤＳ－７６病毒鸡源分离株和国外标准株ＡＶ－１２７及１株鹅源腺病毒的ＤＮＡ进行酶切图谱的比较，结果发现４种鸡源分离株与ＡＶ－１２７株用上述６种酶切的片段数分别为４、８、１０、１０、６和７条。各酶切图形、片段大小亦十分相似，表明均为ＥＤＳ－７６病毒。ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔＩ－ＥｃｏＲＩ的双酶切也得到同样结果。鹅源分离株的酶切片段数分别为６、７、９、７、４和１０条，酶切图形和片段大小均与ＡＶ－１２７有很大不同，表明该分离株可能为１株血清型相同而基因组不同的ＥＤＳ－７６鹅腺病毒。     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

红三叶AFLP体系的建立及优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,以红三叶(Trifolium pratense)高感白粉病品种岷山红三叶与抗白粉病新品系(甘农PR1)杂交产生F1代作为试验材料,对红三叶AFLP反应中7个因素(DNA浓度,酶切时间,两酶(EcoRI,MseI)浓度,预扩增产物稀释倍数,2×PCR Master Mix用量,引物组合)进行优化试验。建立了适合红三叶稳定且多态性高的最佳AFLP反应体系:90ng/μL DNA模板、5h酶切、8UEcoRI、6UMseI、30倍稀释预扩增产物、10μL 2×PCR Master Mix。优化的AFLP反应体系在红三叶的验证中表现出良好的稳定性和重复性,为进一步进行红三叶种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。     

AFLP fingerprinting for paternity testing in ducks

1. The accuracy and reproducibility of AFLP fingerprinting was investigated in the duck (Anas Platyrhynchos), using a multicolour fluorescent labeling technique. The fluorescent labelling fragments were separated on a capillary electrophoresis-base ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer. 2. A total of 337 AFLP peaks with 103 of them being polymorphic markers were generated by 16 sets consisting of EcoRI/TaqI primer pair combinations. The number and size range of AFLP polymorphisms detected per primer pair varied from 3 to 11 and 58 to 290 bp, respectively. About 30.6% (103/337) of AFLP peaks were detected polymorphisms, with an average of 6.4 polymorphic markers per primer pair. 3. The clear polymorphic peaks were amplified with EcoR+AC/Taq+AC primer combinations. The AFLP peaks showed high reproducibility. From the family testing, we found that the fingerprints of all the offspring were derived from one or other parent. Therefore, we conclude that AFLP fingerprinting might be a suitable method for duck paternity testing.     

桑天牛遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

建立适合的AFLP反应体系研究桑树主要害虫桑天牛(Apriona germari)的遗传多样性,有助于从分子水平分析桑天牛不同地理种群的遗传多样性以及开辟害虫防治新途径。对提取的桑天牛成虫基因组DNA预扩增中的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量以及选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq酶的用量等进行单因素试验,优化反应体系。确定预扩增反应体系中的Mg2+终浓度为1.50mmol/L,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为10.0×10-7mol/L,Taq酶用量为1.00U;确定选择性扩增反应体系中的预扩增产物稀释倍数为40倍,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为5.00×10-7mol/L,Mg2+终浓度为1.50mmol/L,Taq酶用量为1.00U。用优化后的反应体系扩增得到了条带清晰的桑天牛AFLP图谱。     

RAPD技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用

以中苜一号苜蓿和繁盐苜蓿大西洋为材料,应用RAPD技术,对14组280条随机引物进行筛选,结果表明:OPW三条引物、OPV三条引物、OPM四条引物、OPT五条引物、OPQ五条引物、OPZ三条引物、OPP三条引物、OPK三条引物、OPL一条引物、OPO七三条引物,共37条都呆作炎DNA多态性引物,为耐盐苜蓿的耐盐基因分子遗传标记的研究奠定了基础。     

大肠杆菌免疫刺激DNA的克隆及其对抗体产生的影响

利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从大肠杆菌基因组中扩增免疫刺激基因，并把扩增的基因片段克隆和pGEM－T载体。PstI酶切结果表明重组质粒（rP）均含有扩增的基因片段；rP1与rP2是相同的重组质粒。利用酶联免疫吸附检测了重组质粒对小鼠产生抗体的影响，结果显示：重组质粒1与牛血清白蛋白（BSA），免疫小鼠能产生较同的抗体水平，而重组质粒3则对小鼠产生的BSA抗体水平没有影响。对重组质粒1的序列分析,克隆的基因片段中富含CpG序列，并含有数个具有强烈免疫刺激作用的RRCGYY（如：AACGTT）序列。本研究为基因免疫机理的深入研究和基因免疫佐剂的开发奠定了基础。     

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究

根据鸡毒支原体 (MG)、禽衣阿华支原体 (MI)、鸡滑液囊支原体 (MS)的基因文库 ,设计了 3对分别与MG、MI、MS某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的MG、MI、MSDNA模板进行多重聚合酶链式反应 (PCR)扩增 ,结果均同时得到了 3条特异性的大小与实验设计相符的 732bp (MG)、 2 99bp (MI)、 2 0 7bp (MS)多重的PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果能同时检出 1pg的MG、MI和MSDNA模板     

小反刍兽疫病毒N、H和F蛋白的真核表达

目的构建小反刍兽疫病毒(PPRV)H、N、F、NF重组真核表达质粒并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的N、H、F基因序列并克隆到真核表达载体pIRES1neo中,最后用PCR、酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒以磷酸钙介导法转染Vero细胞,用免疫荧光方法鉴定其在细胞中的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;重组质粒经pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫病毒N、H、F蛋白基因序列完全一致,其大小分别为1575bp、1830bp和1641bp;将重组质粒感染真核细胞,经免疫荧光检测,证明所有蛋白均得到表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF,为继续进行基因免疫研究奠定了基础。