菜粉蝶分离的微孢子虫对家蚕的病原性研究

从广州市石牌地区捕捉的菜粉蝶(Pieris rapae L.)成虫分离到微孢子虫,1995年春期检出率高达51.3％,秋期检出率亦有20.0％。微孢子虫孢子略有差异,绝大多数为长卵形,极少数为椭园形。长卵形孢子长径为3.76±0.120μm,短径为2.50±0.021μm,长短径比为1.50,体积为12.30μm~3,对家蚕有较强的食下感染能力,感染家蚕后可经卵传给子代。以家蚕微粒子虫孢子特异抗体致敏的胶乳颗粒行凝集反应呈阴性。     

广西野外昆虫微孢子虫对家蚕交叉感染情况调查

为了了解广西野外昆虫微孢子虫对家蚕交叉感染情况,开展了对野外昆虫感染微孢子虫情况调查,并研究其对家蚕的感染性。调查了桑螟、桑尺蠖、菜粉蝶、斜纹夜蛾和桑毛虫等昆虫的微粒子病自然感染率,测试菜粉蝶、桑尺蠖、斜纹夜蛾微孢子虫对家蚕的病原性及可能存在的自然感染方式,观察野外昆虫微孢子虫孢子的形态差异。结果表明:菜粉蝶、桑尺蠖微孢子虫对家蚕蚁蚕的半数感染浓度(IC50)分别为2.69×105个/mL和7.42×105个/mL,斜纹夜蛾微孢子虫对家蚕也具有食下感染能力,菜粉蝶微孢子虫对家蚕也有轻微的胚种传染能力。带病野外昆虫可以通过粪便或鳞毛传播孢子虫。虽然上述野外昆虫微孢子虫的形态与家蚕微粒子孢子虫具有明显差异,但对家蚕都有较强的交叉感染性。     

不同来源的昆虫微孢子虫对家蚕的感染力与体外发芽率调查

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶、桑尺蠖、斜纹夜蛾的体内收集到5种微孢子虫,以家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)为对照,检测不同来源昆虫微孢子虫对家蚕的感染力,并调查各种微孢子虫在体外用家蚕肠液与KOH混合液(pH10.5)处理后的发芽率。从菜粉蝶分离的微孢子虫(PrL M)、从不同来源桑尺蠖分离的2种微孢子虫(PaB MⅠ和PaB MⅡ)、从不同来源斜纹夜蛾分离的2种微孢子虫(Sl MⅠ和Sl MⅡ)以及家蚕微孢子虫对家蚕(蚁蚕)的半数感染浓度(IC50)分别为2.15×105、2.90×105、5.62×106、3.38×107、9.05×106和1.86×105mL-1;PrL M、PaB MⅠ、PaB MⅡ、Sl MⅠ、Sl MⅡ和Nb的体外发芽率分别为76.75%、76.00%、12.50%、2.25%、2.75%和59.25%。PrL M和PaB MⅠ对家蚕的半数感染浓度与Nb接近,对家蚕的致病性较强,2种微孢子虫经家蚕肠液与KOH混合液处理后的体外发芽率也较高;PaB MⅡ、Sl MⅠ和Sl MⅡ对家蚕的半数感染浓度依次是Nb的30倍、182倍、49倍,说明这3种昆虫微孢子虫对家蚕的感染力较弱,并且3种微孢子虫的体外发芽率也很低。     

家蚕异形微孢子虫与交叉传染

由于检测手段的改进，七十年代初，在日本蚕种生产过程中，发现了一些与家蚕微粒子虫孢子（Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ）形态不同的微孢子虫以来，国内外众多学者开展了异型微孢子虫的分离和鉴定工作，发现了许多异形微孢子虫。且多数研究者和蚕种生产者认为，家蚕中分离到的异形微孢子虫主要来源于野外昆虫的交叉传染，我国家蚕微粒子病发生率的上升与野外昆虫的交叉传染关系密切。本文就有关方面的研究作一综合，期望对家蚕微粒子病的防治有所助益。二 异型徽抱子虫 根据目前分舟到的微抱子虫的形态结构、血清学特点、增殖特点、对家…     

家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究

在ＤＮＡ水平上，以聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｏｎ，ＰＣＲ）技术检测家蚕微孢子虫的结果。设计、合成了两对引物，其中引物Ⅰ是针对家蚕微泡子虫（ＮｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓＮ．ｂ．）引物Ⅱ是针对变形孢子虫（ＶａｉｒｉｍｏｒｐｈａｎｅｃａｔｒｉｘＶ．ｎ，）的。用这两对引物分别对“桑尺蠖微孢子虫”孢子ＤＮＡ和Ｎ．ｂ．（镇江株）的纯孢子及其感染的幼虫、蛹及蛾的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均获得预期的阳性条带；对不同引物扩增的产物进行了ＤＮＡ序列分析。初步认为引物Ⅰ可作为家蚕微孢子虫Ｎ．ｂ．特异性较高的检测引物，而引物１是微孢子虫共有的检测引物。进一步讨论了对家蚕微孢子的检测及分类上的问题。     

桑尺蠖和丝棉木金星尺蠖的微孢子虫对家蚕病原性和胚种传染性研究

从桑尺蠖（ＨｅｍｅｒｏｐｈｉｌａａｔｒｉｌｉｎｅａｔａＢｕｔｌｅｒ）中分离的微孢子虫（简称桑尺蠖微孢子虫），形态为长卵圆形，大小为３．５～４．１×１．６～１．９μｍ。从丝棉木金星尺蠖（ＣａｌｏｓｐｉｌｏｓｓｕｓｐｅｃｔａＷａｒｒｅｎ）中分离的微孢子虫（简称丝棉木金星尺蠖微孢子虫），形状为卵圆形，大小为３．２～３．７×１．６～２．１μｍ。两种微孢子虫均能感染寄生家蚕的主要组织器官，引起蚕儿发病，但致病力要比家蚕微孢子虫（Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ）弱，且能经卵传染给下一代，其胚种传染率要比家蚕微孢子虫低。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。     

感染菜粉蝶的两种微孢子虫的研究（Ⅰ）病原形态及对家蚕的病原性

作从菜粉蝶成虫体中分离到两种不同形态的微孢子虫M－Pr1和M－Pr2。对这两种微孢子虫的形态及对家蚕的病原民生进行了研究，结果表明这两种微孢子虫均对家蚕有强的食下感染能力，并可对家蚕胚种传染。     

菜粉蝶微孢子虫的多态性及对家蚕感染性的初步研究

从四川三台蚕区捕捉到的菜粉蝶中,分离出形态、大小不同的五种微孢子虫。第一长卵圆形大小为:3.75±0.089~*1.69±0.070μm;第二长卵圆形大小为:3.51±0.079~*1.35±0.05μm;第一卵圆形大小为:3.20±0.179~*1.93±0.086μm;第二卵圆形大小为:3.50±0.075~*2.10±0.040μm;小形微孢子虫大小为:2.50±0.080~*1.15±0.51μm。五种微孢子虫对家蚕均有感染能力,除小形微孢子虫外,对家蚕均能全身寄生,但对小形微孢子虫的感染寄生部位还暂时不明。     

家蚕病原性微孢子虫SCM_7（Endoreticulatus．sp）的分离和研究

从四川省种茧育家蚕分离出的一种小型微孢子虫ＳＣＭ７，仅感染寄生蚕的中肠上皮组织；孢子卵圆形，大小２．２６±０．２１×１．１９±０．１８μｍ，孢子具单核，极丝排列７─９圈，各阶段的发育均发生在由寄主细胞内质网膜所形成的寄生囊内。其它特点也与Ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ属相符，应分类于Ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ属。该属微孢子虫在家蚕体内尚属首次发现。     

家蚕微孢子虫感染家蚕对其中肠和血液蛋白酶活性影响

本试验测定了不同浓度剂量微孢子虫感染家蚕后,家蚕中肠和血液中蛋白酶的变化.并对不同浓度剂量家蚕微孢子虫感染家蚕后对家蚕发育的影响和不同组织中所含微孢子虫孢子的浓度等作了初步的研究.从本实验中可以看出,感染不同浓度微孢子虫的家蚕,体内相同组织的微孢子虫数量存在显著差异.而感染相同浓度微孢子虫的蚕,不同组织中微孢子虫的数量也有差异,中肠的微孢子虫数量远高于其他部位.感染微孢子虫后,家蚕血液中的蛋白酶活性显著升高,中肠的蛋白酶的活性变化不显著,而感染微孢子虫的数量对血液和中肠中的蛋白酶的活性无显著影响.     

2种野外昆虫来源微孢子虫的超微结构及生活史观察

将从湖南蚕区野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Phthonandria atrilineata)分离到的2种微孢子虫感染家蚕,观察微孢子虫的寄生组织、生活史以及原代微孢子虫与在蚕体侵染繁殖的第1代微孢子虫的超微结构,作为探讨家蚕微粒子病发生与野外昆虫微孢子虫的关系的病原生物学依据之一。用Giemsa染色镜检观察的结果显示,2种来源的微孢子虫可在家蚕幼虫体内全面寄生,在中肠、丝腺、马氏管、脂肪体、生殖腺、肌肉组织、气管丛等组织中均能检出。电子显微镜观察2种来源的微孢子虫的超微结构,并与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)比较,结果显示在家蚕体内继代的源自菜粉蝶和桑尺蠖的微孢子虫的超微结构特征与Nb基本一致,孢子壁由3层组成,极体分为前后2部分,极丝同型,核成对出现,核形不规则,核膜双层,粗面内质网附含大量的核糖体,孢子后部有后极泡。2种来源的微孢子虫在家蚕体内的发育过程较为相似,所有时期的核都成对出现,以二分裂方式增殖,发育周期分别为72、96 h。     

家蚕微孢子原虫(Nosema bombycis)在Antheraea eucalypti细胞中的增殖

家蚕微孢子原虫（ Ｎｏｓｅ ｍ ａ ｂｏ ｍ ｂｙｃｉｓ） 经 Ｋ Ｏ Ｈ 处理后,接种于 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系,调查其生活史。 Ｋ Ｏ Ｈ 处理的孢子发芽率约为４４３ ％ 、 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞的初期感染率约为３０ ％ ,接种３６ｈ 后,裂殖子数量急速增加,７２ｈ 达到最高峰。接种４８ｈ 后可观察到短极丝孢子发芽后形成的空孢壳和二次感染体。感染 Ｎｏｓｅｍ ａ ｂｏ ｍｂｙｃｉｓ ４８ｈ 前的家蚕血淋巴对 Ｂｍ Ｎ 细胞无感染性,而感染７２ｈ 的血淋巴则表现出感染能力。     

两种微孢子虫孢子表面蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

对来自家蚕的内网虫属样微孢子虫和家蚕微孢子虫的形态、表面蛋白及侵染性进行了比较研究。内网虫属样微孢子虫孢子显著小于家蚕微孢子虫 ,孢囊中孢子数为 8～ 32个 ,只侵染中肠组织 ,对家蚕无胚胎传染性。SDS UreaPAGE和 2D PAGE图谱显示两种孢子表面蛋白有明显差异。在SDS UreaPAGE中 ,内网虫属样微孢子虫的主要表面蛋白为 2 2kD ,而家蚕微孢子虫为 4 5kD。 2D PAGE显示 ,当上样量为 12 0 μg时 ,内网虫属样微孢子虫孢子表面蛋白斑点有 330多个 ,而家蚕微孢子虫孢子只有 16 0多个 ,其中仅有 10多个相同或疑似蛋白点。家蚕微孢子虫的主要表面蛋白点约有 2 0个 ,以中性偏酸的小分子居多 (<18kD ,pI 5 .4～ 7.2 ) ;内网虫属样微孢子虫有 30多个 ,分布较分散。根据两种孢子都能感染家蚕的特点 ,认为相同或疑似蛋白与是否能够感染有关 ,而大量差异蛋白与对家蚕的感染程度有关。两孢子表面蛋白中的主要蛋白均为差异蛋白 ,可能是孢子表面的结构蛋白。     

一种基于蛋白质组的方法鉴定家蚕微孢子虫中宿主——寄生虫相关的一些主要结构蛋白

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）引起的家蚕微粒子病给全世界养蚕业带来巨大的经济损失。这种与真菌相关的属于微孢子门的寄生物以孢子形式专性寄生在细胞内，目前在分子水平上对宿主与寄生物间相互关系还知之甚少。已有研究表明，微孢子虫的大多数孢子壁蛋白和极管蛋白与侵染宿主有关。本研究应用基于蛋白质组学的方法，鉴定一些家蚕微孢子虫的细胞结构蛋白。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制

通过5种对家蚕微孢子虫发育有抑制作用的化学药剂--脓微灵、防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛不同处理时期、时间在体外对家蚕微孢子虫发育、增殖影响的研究表明：供试的5种化学药剂对家蚕微孢子虫体外发育、增殖均产生不同程度的抑制作用。脓微灵的显抑制作用的时期表现在从接种0h开始的处理区，孢子形成数仅为对照的11.89%～15.68%，主要体现为对微孢子虫、芽体的杀灭作用或对微孢子发芽的抑制作用。防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛对家蚕微孢子虫体外发生、增殖抑制作用最显的时期，均表现在接种24h～72h，从裂殖体分裂、增殖到孢子形成期之前这一对外界环境条件的变化最为敏感的发育阶段，尤以48h～72h最有效，其孢子形成数为对照的22%～38%。而抑制作用与化学药剂作用时间长短的相关性则不十分明显。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。     

菜粉蝶微孢子虫对家蚕为害研究初报

菜粉蝶微孢子虫对菜粉蝶成虫的自然寄生率达20%左右;菜粉蝶微孢子虫形态多样,大小极不整齐;菜粉蝶微孢子虫为害家蚕,繁殖周期5~8天,感病率可达100%,致病力弱,有较强的胚种传染。     

家蚕微孢子虫孢子DNA的提取、克隆及部分DNA序列分析

报道家蚕微孢子虫（Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ简称Ｎ．ｂ）孢子ＤＮＡ的提取、克隆及部分ＤＮＡ序列测定的结果。采用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ将孢子破碎，用苯酚一氯仿法提取孢子的ＤＮＡ。将Ｎ．ｂ孢子ＤＮＡ与ｐＴＺ１８Ｒ质粒重组，转化于大肠杆菌ＤＨ５，获得４个阳性克隆株：ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ１，插入片段为１ｋｂ；ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ２，为１．２ｋｂ；ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ３为１．８ｋｂ及ｐＴＺ１８ＲＮ．ｂ４为１．９ｋｂ，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，证实插入的ＤＮＡ片段为家蚕Ｎ．ｂ孢子所特有。与ＭＧ１（Ｎｏｓｅｍａｓｐ．），蓖麻蚕微孢子虫、蓝萤叶甲微孢子虫及蚕卵的ＤＮＡ均无同源性。用双脱氧链终止法测定４个克隆株插入片段的部分ＤＮＡ的序列，经检索尚未发现同源性的基因序列。讨论了ＰＣＲ技术诊断家蚕微孢子虫孢子与近缘种的问题。