RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

甘蓝型油菜GPAT6基因在酵母和拟南芥中的表达分析

利用同源克隆法获得‘湘油15’中长度为1 506 bp的GPAT6基因,并通过酿酒酵母质粒YES2.0和特异性启动子Napin构建了酵母表达载体和植物种子特异表达载体,分别转化酵母和拟南芥。气相色谱分析表明：转BnGPAT6基因的酵母中C14:0脂肪酸比对照高一倍,而C16:0,C16:1,C18:0和C18:1所占比例均明显下降。转基因拟南芥4个株系中种子的总含油量均下降,其中C16:0、C18:2和C18:3的比例略有升高。推测BnGPAT6在油菜中的功能与含油量关系不大,可能参与几丁质、软木脂等物质的生物合成途径。     

MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达

以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15蛋白的同源性为61%, 其中在MADS区的同源性为84.3%, K区的同源性为63.2%。半定量RT-PCR分析表明, GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量RT-PCR分析发现, GmAGL15在大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后30 d的幼胚中表达量最高。以上结果显示, 基因GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。     

春兰AGL6基因的克隆及实时定量表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到一个AGL6基因。序列分析表明,该基因含有一个729bp长的开放阅读框(ORF),共编码242个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因属于MADS-box基因家族AP1/AGL9组的AGL6同源基因,其编码的蛋白与其它植物AGL6类蛋白具有较高的同源性,命名为CgAGL6(基因登录号为HM208533)。实时荧光定量表达分析表明,CgAGL6基因春兰不同组织中均有表达,其中在唇瓣、花芽和子房中的表达量较高,在花瓣和萼片中的表达量次之,在根、叶和蕊柱中的表达量最低,显示了CgAGL6基因可能在春兰成花转变和花器官的形成过程中起着重要作用。     

Napin启动子特异性表达油菜BnGPAT9基因

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)基因编码参与植物油脂生物合成的酶。为了提高油菜籽含油量,促进油菜增产增油,改善菜籽油脂肪酸组分,克隆甘蓝型油菜Napin启动子与三酰甘油合成相关基因BnGPAT9,构建pBI121-Napin-BnGPAT9植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,采用气相色谱法分析种子中脂肪酸组分,通过索式抽提法测定种子中油脂含量,研究在种子中过表达BnGPAT9基因对种子油脂合成的影响。Napin启动子在线分析表明,克隆到的启动子具有大量TATA-box、CAAT-box以及ABRE、GCN4等特征元件,完全具备种子特异性表达功能;种子中脂肪酸组分分析显示,拟南芥种子中油酸(C18∶1)含量提高0.70～1.01百分点,亚油酸(C18∶2)和芥酸(C22∶1)含量降低;拟南芥种子含油量测定结果显示,种子中含油量显著增加1.91～2.56百分点。综上,甘蓝型油菜BnGPAT9基因对植物油脂合成具有重要作用,利用Napin启动子在拟南芥种子中过表达BnGPAT9基因可提高种子含油量并改善脂肪酸组成成分,为BnGPAT9基因应用于油菜油脂改良方面打下一定基础。     

MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达

以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15蛋白的同源性为61%, 其中在MADS区的同源性为84.3%, K区的同源性为63.2%。半定量RT-PCR分析表明, GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量RT-PCR分析发现, GmAGL15在大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后30 d的幼胚中表达量最高。以上结果显示, 基因GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。     

NAD-IDH亚基1基因在油菜花粉与种子发育过程中的表达规律

以甘蓝型油菜不同发育时期的花粉与种子为材料,开展了有关NAD-IDH亚基1基因表达规律的研究。结果表明,不同发育时期花粉与种子的NAD-IDH比活力均比叶片的高。花粉与种子发育过程中NAD-IDH比活力均呈抛物线状变化,这与亚基1基因的RNA定量斑点杂交和定量RT-PCR揭示的花粉与种子发育过程中NAD-IDH亚基1基因mRNA量的变化规律完     

以器官和发育特异性抗病双基因转化油菜

菌核病是我国油菜主产区的主要病害，系由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的子囊孢子在晚春直接侵染开花植株衰老的叶片，或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后再产生菌丝侵入叶片和植株本体。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成成分，几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素，草酸氧化酶能够分解草酸，缓解核盘菌在油菜体内的毒性。我们将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子PSAG12嵌合在一起构建成表达载体，使两外源抗病基因仅在转基因油菜的衰老叶片中表达，在发挥抗病作用的同时最大限度地节约了植物的能量消耗。本实验采用in planta的转化方法，转化效率在0．1％左右，每个转基因植株的插入位点为1——3个拷贝。对T1代转基因植株的RT-PCR分析表明，两个外源抗病基因在衰老叶片中的表达强于幼嫩叶片。转基因植株叶片尤其是衰老叶片对核盘菌的抗性及对草酸毒素的耐性均得到了增强。从转基因植株上飘落的花瓣也表现出对核盘菌抗性的提高。抗病双基因在叶片和花瓣发育的特定时期表达不仅提高了油菜对核盘菌侵染的针对性，还可能减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱。对转基因植株后代的农艺学和生理学研究正在进行之中。     

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列（1138bp）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因保守序列（181bp）,将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5＇末端,以反向的方式连接到该内含子的3＇末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3＇末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针，对NCa不育系、保持系和可育F1幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rnn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F1中的转录没有差异，只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1．1、0．9和0．6kb，orf139检测到0．8和0．6kb2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0．6kb转录本，而在可育F1中检测到0．6和1．2kb的转录本。NCaCMS不育的形成可能与orf222、orf39和atp9基因的表达有关。讨论了恢复基因在F1育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析

从甘蓝型油菜中克隆了MAPK7基因家族3个成员BnMAPK7-1、BnMAPK7-2和BnMAPK7-3的全长cDNA序列,它们最长标准mRNA分别为1593、1434和1547 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK7基因全部来自白菜,而且BnMAPK7-1/-2的是由白菜Bra03723祖先基因加倍产生的,而BnMAPK7-3则由白菜中Bra037234的祖先基因进化形成的。同时,克隆获得BnMAPK7-1/-2的启动子序列,该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达,并发现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA、SA)、信号分子(H₂O₂)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,初步证明甘蓝型油菜MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜MAPK7-1/-3基因的原核表达,并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在,为后续的研究提供了基础。     

不同环境中甘蓝型油菜种皮木质素含量的QTL定位

以甘蓝型黄籽油菜GH06和甘蓝型黑籽油菜中油821为亲本杂交,后代通过“一粒传法”连续自交7代构建重组自交系,2007年分别在重庆市北碚区和万州区2个试验基地种植重组自交系群体,利用本实验室已构建的遗传连锁图谱和复合区间作图法(CIM),对种皮木质素含量进行测定及QTL定位分析。结果在2个环境中共检测到12个种皮木质素含量相关的QTL,分别位于4个不同的连锁群,单个QTL可解释性状表型变异的4.50%~8.79%;在第3连锁群上检测到1个QTL与同一标记EM19ME23/130连锁,其余10个QTL位置不同;在北碚检测到的QTL主要分布于第20连锁群,在万州检测到的QTL主要位于第3连锁群;部分种皮木质素的QTL与种胚类黄酮和种皮色泽的QTL位于相近区间,在北碚和万州种皮木质素含量与种胚类黄酮存在极显著和显著正相关关系。结果表明甘蓝型油菜种皮木质素含量表现为多基因控制的数量性状,基因表达受环境影响较大;油菜种皮木质素合成和类黄酮的积累可能受相同关键基因调控或者具有部分相同的合成代谢途径。     

甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制,采用RT-PCR法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并对甘蓝型油菜种子TIP4;1基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。结果表明,TIP4;1基因在干种子中表达水平很低,但是在种子萌发过程中表达量增加。此外,在干旱、低温及盐的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达上调,结果暗示着该基因可能参与了甘蓝型油菜种子萌发和逆境响应过程。随着研究的深入,水孔蛋白的水分调控机制将进一步被揭示,这对于解决干旱胁迫和盐胁迫等实际问题具有重大现实意义。     

利用SNP高密度遗传连锁图谱定位甘蓝型油菜种子硫苷含量的QTL

种子硫苷在甘蓝型油菜中有着重要的生物学作用和经济价值。本文旨在通过复合区间作图法利用高密度SNP遗传连锁图谱定位种子硫苷的QTL。用近红外扫描获得种子硫苷含量,每株系扫描3次,取平均值。所用的高密度SNP遗传图谱包含2795个SNP多态性标记位点,图谱总长1832.9 cM,相邻标记间平均距离为0.66 cM。定位了2年的种子硫苷含量QTL,其中有5个在2年内被重复检测到,分别分布在A03、A09和C02染色体上,LOD阈值在2.90~10.40之间。这些QTL在2011和2012年试验中分别解释了56.9%和55.1%的表型变异。另外有5个QTL仅在其中一年被检测到,这些QTL能够解释4.1%~7.9%的表型变异,QTL阈值在2.53~3.83之间。     

甘蓝型油菜异三聚体G蛋白原生质体瞬时表达体系的建立

为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10.73×10~6/m L,活力可达96.4%。采用30%PEG转化原生质体时,目的蛋白表达量最高。Western Bolt的检测分析表明,异三聚体G蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ABA的应答反应,当ABA浓度分别为100,150,100,50 mmol/L时,Bn GA1、Bn GB1、Bn GG2和BnRGS1蛋白的表达量最高。     

甘蓝型油菜SLG基因片段的克隆及序列分析

通过不同甘蓝型油菜中SLG基因的克隆及序列分析, 探索了甘蓝型油菜中是否存在与芸薹属二倍体中相同或相似的S-locus基因。对10个甘蓝型油菜品种和品系中SLG基因的PCR扩增和序列比较分析发现, 这些甘蓝型油菜中都存在第2类的SLG基因, 而且, 同二倍体芸薹属物种一样, 第2类SLG基因之间具有较高的同源性; 只有5个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类SLG基因, 而且这些基因序列之间表现出高度的保守性, 即同源性在96%以上, 明显高于不同等位基因之间的同源性。这些甘蓝型油菜中的class I SLG基因可能源于同一个自交不亲和单体。     

油菜育性相关多聚半乳糖醛酸酶基因MF6的获得及表达分析

本研究目的在于利用化学杀雄剂"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜R121产生雄性不育,并对花蕾中的差异表达基因进行分离、筛选及定量表达分析。首先,通过抑制消减杂交技术(SSH)和反向Northern斑点杂交技术,分离和筛选出在雄性不育花蕾中差异表达的基因片段。然后,将差异片段测序后在NCBI数据库中进行同源性比对及功能分析。最后,对差异表达基因进行反转录荧光定量表达(RT-QPCR)分析。本研究从筛选出来的6个阳性克隆中获得一个与多聚半乳糖醛酸酶基因(MF6)100%同源的基因片段,该基因被认为与花粉生长发育及花粉成熟密切相关。对MF6基因在不同长度及不同育性花蕾中的表达量进行了定量分析,结果显示,MF6基因在雄性可育花蕾中的表达量均高于雄性不育花蕾,且在蕾长1.00mm～1.50mm和3.50mm～4.00mm时分别达到了18.53倍和43.15倍的差异。因此,我们推测"化杀灵WP1"主要通过抑制花粉母细胞减数分裂时期中MF6基因的表达,使花粉产生败育;同时,MF6基因的表达可能也与花丝的伸长生长有关。