水稻RNAi突变体库的创制和筛选

通过转化水稻hp RNA农杆菌文库至粳稻品种台北309,获得143株转基因植株。随机选取36株T0代转基因植株进行检测,其GUS阳性率为77.78%,且其中35份PCR阳性材料的插入片段均与粳稻日本晴的m RNA有较高匹配。对61份T1代突变体进行筛选,获得33份有突变表型的材料。初步获得1份类病斑突变体,序列分析表明其可能干扰基因的编码产物为RAL6-种子过敏蛋白RA5/RA14/RA17的前体,属于淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族,该类基因在植物自然防御系统中扮演重要较色。     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

籼型杂交水稻恢复系“752”抗除草剂转基因研究

用基因枪法对籼型杂交水稻恢复系“75 2”进行了bar基因的遗传转化 ,共获得可育的抗除草剂Basta的转基因株系 6个。PCR检测结果表明 ,抗性转基因植株表现为阳性 ,而非转化的对照表现为阴性 ,证明T0 代转基因水稻基因组中整合有bar基因。转基因植株的抗性能遗传至后代 ,在T1 代中观察到了抗、感分离现象     

大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

利用基因枪法获得可遗传的抗除草剂转基因水稻植株

 利用基因枪转化系统，将含有由CaMV35S启动子启动的bar基因的转化质粒pCB1导入水稻幼胚，经筛选、再生得到3株抗除草剂Basta的转基因植株。经PCR及Southern分析，在转基因植株基因组中均检测到了bar基因的整合；经RNA点杂交分析，检测到了bar基因在转基因植株中RNA水平的表达。在转基因植株JY119-2的总计321株T#-1代自交后代中，有274株表现出除草剂抗性，47株敏感。从该274株抗性植株中随机选取8株进行Southern分析，结果均检测到了bar基因的整合，表明bar基因已遗传到了T#-1代植株中。     

水稻Os-miR390前体基因的克隆、载体构建及转化

【目的】microRNA是一类长度为21~23 nt的非编码小分子RNA,对动植物的正常发育具有非常重要的调节作用。水稻Os-miR390的功能可能与生长素应答相关,拟采用转基因方法研究其生物学功能。【方法】根据水稻Os-miR390的前体RNA结构特点合理设计引物,从水稻基因组中克隆出其前体DNA片段,将其构建在玉米UbiI启动子驱动的表达载体中,并转入水稻。【结果】利用PCR成功地从水稻基因组中扩增出了Os-miR390前体基因,并将其构建在UbiI水稻组成型启动子下。经农杆菌介导,将其成功转入水稻愈伤,获得抗性幼苗,经过PCR检测,得到阳性转基因植株。【结论】T0代转基因植株表现叶片黄化的特征,待T1至T2代性状稳定后结合研究靶基因可深入研究其功能。     

农杆菌介导的抗除草剂基因Bar转入北方粳稻恢复系的研究

以2个北方粳型恢复系津稻162和津稻18为受体,经农杆菌EHA105/pDSBar1300转化,分别获得77和55个转植株。用0.25%浓度的Basta对转基因在T0代进行了涂布试验,其抗性植株率分别为92%和78%,对除草剂抗性转基因株系做PCR检测,均能扩增出400bp的Bar基因特异条带,证明外源基因已整合到水稻基因组中。对转基因T1代进行潮霉素抗性鉴定,大多数转基因株系表现为3∶1的分离比。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

水稻OsFRK1与OsFRK2基因CRISPR敲除突变体的构建

为揭示水稻果糖激酶(OsFRK)家族基因的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术,成功创建了2个已鉴定了的水稻OsFRK家族基因的敲除突变体;获得28株OsFRK1的T0代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为100%、46.43%和10.71%;获得14株OsFRK2的T0代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为92.86%、92.86%和21.43%;T0代敲除纯合突变体中目的蛋白质的功能结构域均发生不同程度的破坏。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

转大豆铁结合蛋白基因水稻的初步研究

采用冻融法将含有大豆铁结合基因的质粒pGTV-35S-fer转入农杆菌菌株LBA4404中,以宁夏4个水稻主栽品种为受体材料,通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织,经2轮次除草剂筛选获得了再生植株。经过对转化植株的PCR扩增检测,证明外源大豆铁结合基因已经转入宁夏水稻植株中。大豆铁结合蛋白基因在水稻种子中特异表达,转基因植株种子中的铁含量是未转化植株的1.7~2.2倍。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。     

转cry1C~*籼型抗虫节水抗旱稻的获得及鉴定

通过农杆菌介导的遗传转化方法,将cry1C*基因导入籼型节水抗旱稻品种‘旱恢3号’中。通过对Basta抗性植株的PCR筛选和Southern检测证实,cry1C*基因已整合到受体品种中;田间自然感虫试验显示,转基因植株对稻纵卷叶螟具有明显的抗性。     

无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育

 为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系，将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因（HPT）分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中，并经农杆菌介导，将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中，获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明，AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中，并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察，选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系；抗病性鉴定结果表明，转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高，部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。     

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

Agrobacterium-mediated Transformation of Rice (Oryza sativa L.) with Atrazine Chlorohydrolase Gene (atzA)

Atrazine chlorohydrolase gene (atzA) was cloned from Arthrobacter sp. AD1. A plant expression plasmid was constructed under the control of CaMV35s promoter and was used in rice transformation. The target gene was successfully introduced into mature embryos of a japonica rice cultivar Jindao 107 by Agrobacterium- mediated transformation and hundreds of transgenic plants were obtained. The exogenous atzA gene in the transgenic plants that expressed atrazine resistance was confirmed by Southern blot hybridization. The resistance experiments by spraying transgenic rice plants with 0.133% atrazine shown that most of the transgenic rice plants exhibited the resistance to herbicide atrazine. The segregation of exogenous atzA gene in T1 progeny corresponded to the Mendelian ratio.     

Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance

In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene （HPT） were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type.     

籼稻1701转Pi9基因株系的遗传分析及抗瘟性鉴定

利用农杆菌介导法将广谱抗稻瘟病基因Pi9导入籼稻品种1701中,得到了大量的T1代和T2代转基因植株.对T2代植株进行遗传分析和稻瘟病抗性鉴定,结果表明,外源基因Pi9已转入到受体基因组中,并在T2代植株中得到表达.