春兰根内生细菌分离培养方法的初步研究

探讨了春兰根表面灭菌的最佳条件,以及改良察氏琼脂、淀粉铵营养琼脂、YG、R2A、LB、金氏、TSA和根系分泌物8种培养基对春兰根内生细菌的分离效果。结果表明:春兰根的最佳表面灭菌条件为:75%乙醇浸泡3 min,3%次氯酸钠溶液处理2 min,75%乙醇浸泡30 s,最后用无菌水冲洗。不同培养基对内生细菌的分离存在一定差异,R2A培养基和根系分泌物培养基分离出的内生细菌数量较多,而YG培养基和R2A培养基分离出的内生细菌种类总数最多。此8种培养基对春兰根内生细菌的优势菌群的分离效果是相同的。研究结果可为选择合适的表面灭菌条件及培养基分离兰花内生细菌提供参考。     

乌鲁木齐10号冷泉水中可培养细菌群落结构组成

[目的]了解乌鲁木齐10号冷泉水中可培养细菌群落结构组成,以及嗜盐微生物的分离鉴定.[方法]梯度稀释乌鲁木齐10号冷泉水,采用TSA、2A、0.1 ×LB、HM等4种培养基进行分离纯化.其中采用0.1;、0.5;、1;、2;、5;和10; NaCl的HM培养基分离嗜盐微生物.CTAB法提取所得菌株DNA,用细菌通用引物27F/1492R扩增16SrRNA基因,构建系统发育树.[结果]分离得到33株不同基因型细菌,16SrRNA测序、BLAST比对及系统发育分析将其归为假单胞菌属、金黄杆菌属、红杆菌属、芽孢杆菌属等,其中假单胞菌属占优势.R2A培养基分离效果较好,HM培养基在NaCl 5;～20;区间分离到的菌株数较多.[结论]乌鲁木齐10号冷泉水可培养细菌多样性较低,而中度嗜盐菌数量较丰富.     

烤烟K326种子可培养内生细菌的分离与鉴定

采用NA、KB、R2A和TSA 4种培养基分离烟草品种K326种子中的可培养内生细菌,并选择其中的50株外观形态特征有显著差异的菌株进行了16S r DNA测序与分析。结果表明,烟草K326种子中携带有大量可培养内生细菌,培养获得菌落总数约为8.1×105cfu/g;主要分为假单胞菌属、寡养单胞菌属、芽孢杆菌属、贪铜菌属和杆菌属等5个属,其中优势内生菌为嗜麦芽寡养单胞菌、假单胞菌和芽孢杆菌,分别占菌种总数的34%、32%和26%。     

小麦内生细菌分离培养基的选择

分别利用肉汁胨琼脂、营养琼脂、胰酶大豆琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、脑心浸液琼脂、金氏培养基B、LB营养琼脂和酵母膏蛋白胨琼脂8种常用的细菌分离培养基来分离小麦内生细菌,以选择适宜的分离培养基,结果显示,胰酶大豆琼脂和金氏培养基B的分离效果显著优于其他培养基,马铃薯葡萄糖琼脂和脑心浸液琼脂的分离效果较差。利用选择出的金氏培养基B和胰酶大豆琼脂分别对豫东麦区的7个小麦品种的内生细菌进行分离,进一步确认了胰酶大豆琼脂和金氏培养基B为分离小麦内生细菌的适宜培养基。     

长白山天池水可培养细菌的16S rRNA鉴定

为了解长白山天池水中细菌的种类及多样性,用NA、1/10NA、R2A、1/10R2A培养基从长白山天池水样品中分离出25株细菌菌株,对其进行16S rRNA基因序列的系统发育分析及形态观察,结果得到9种具有代表性的菌株,9株细菌在系统发育上与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)及厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)关系密切,其中芽孢杆菌属为分离获得的优势菌属.     

不同营养类型培养基番茄内生细菌群落结构研究

通过采用Biolog EcoPlate培养、16S r RNA基因高通量测序技术等方法研究不同培养基上植物内生细菌群落结构的组成差异，探究不同培养基等营养条件对番茄内生细菌群落结构的影响。结果表明：(1)4种培养基上生长的内生菌群在Biolog EcoPlate微平板培养96 h后，菌群生长达到稳定期，且在牛肉膏蛋白胨(NA)培养基下菌群代谢活性较高。R₂A培养基下菌群代谢活性较低。(2)番茄内生微生物组包括柠檬酸杆菌属(Citroebacteria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘脂单胞菌(Sphingbacterium)、布克氏菌属(Burkholderia)。(3)LB、TSA培养基分离到的内生菌多为芽孢杆菌属；在NA、R₂A培养基中番茄内生菌组成多为柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、鞘脂单胞菌、布克氏菌，为优势菌种。(4)NA培养基中番茄内生微生物组香农指数高于其他处理(P<0.05)差异；PCoA分析显示4种培养基中番茄内生细菌群落结构具有差异(P<0.05)。(5)网络分析发现NA、R₂A培养基中番茄内生...     

水葫芦内生细菌的分离与鉴定

采用20种不同培养基分离水葫芦内生细菌,利用细菌脂肪酸鉴定技术对水葫芦的内生细菌进行鉴定,研究了水葫芦内生细菌的种类及群落结构.结果表明,共得到32个属56株内生细菌,种类最多的是微杆菌属(Microbacterium),共有9种细菌.其次为假单胞菌属(Pseudomorms),共有7种细菌.芽孢杆菌属(Bacillus)有 5种细菌.其余23个属均有1种.利用优势度指数分析各培养基分离到内生细菌的多样性,10号葡萄糖、酵母、淀粉琼脂培养基优势度指数为0.160 7,分离得到内生细菌种类最多为9种;其次是4号根瘤菌培养基和11号NA培养基的优势度指数为0.125 0,分离得到的内生菌种类均为7种;16号黄豆芽汁培养基(pH7.2～7.4)和20号醋酸菌培养基,优势度指数为0.089 3,分离获得内生细菌均为5种.     

马齿苋内生细菌的分离鉴定

为丰富我国野生植物内生细菌研究,对野生马齿苋内生细菌进行了分离鉴定。首先对新鲜的马齿苋全株进行表面消毒,充分研磨后,涂布于NA培养基上在28℃下培养1~2d。菌落产生后采用革兰氏染色结合显微观察初步鉴定,再利用16SrDNA序列分析方法,并利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对。结果表明,试验共分离得到6种菌,分别属于:肠杆菌属(E.sakazakil),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),无色杆菌(Achromobacter spp.),类芽孢杆菌属(Paenibacillus),赖氏细菌属(Leifsonia)和Rhodanobacter sp(非模式菌株)。     

青钱柳内生真菌多样性及其代谢产物的特性

为揭示青钱柳内生真菌的分布、多样性及其代谢产物的抑菌活性,并筛选产黄酮的内生真菌,挖掘植物内生真菌新资源,采用组织分离的方法对青钱柳的枝、皮、叶、根部位的内生真菌进行分离,用马丁氏培养基、察氏培养基、PDA培养基对内生真菌进行培养,通过观察内生真菌的形态特征进行初步分类,同时提取其发酵产物,并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌为供试病原菌对分离的内生真菌进行抑菌活性试验,通过显色试验和薄层层析试验筛选出产黄酮的内生真菌.试验共分离得到67株内生真菌,通过菌落形态和显微形态对分离得到的青钱柳内生真菌进行分类,其分别隶属于3纲4目6科10属;青钱柳不同组织中内生真菌的分离结果不同,其中根部分布的内生真菌从数量和种属上都占优势;马丁氏培养基培养的菌株种类少、数量多,而察氏培养基和PDA培养基培养的菌株种类较多、菌株较少;抑菌试验共得到13株具有抑菌作用的内生真菌,其中有2株内生真菌的发酵产物对供试菌株均表现出较强的抑菌活性,分别属于青霉属和链格孢属;并且筛选出7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12和PP06)具有稳定的产生黄酮类化合物的能力.     

副猪嗜血杆菌培养特性及致病性研究

将副猪嗜血杆菌5型分离菌株HE5分别接种于LB、TSA等固体培养基上,接种12 h后通过观察菌落大小,筛选出最适副猪嗜血杆菌生长的TSA固体培养基.同时,将HE5接种于LB、TSB等液体培养基上,通过平板活菌计数,筛选出最佳液体培养基TSB.小鼠感染试验结果表明,培养12～16 h的活菌数最多,对小鼠的致死性最大,为副猪嗜血杆菌感染小动物提供依据.     

马铃薯叶片内生细菌的分离鉴定及其对马铃薯块茎蛾的毒力研究

【目的】研究马铃薯叶片内生细菌对马铃薯块茎蛾幼虫的杀虫活性,为马铃薯块茎蛾生物防治提供理论依据。【方法】以云南省2种马铃薯主栽品种丽薯6号和会-2叶片为材料,采用LB固体培养基分离培养马铃薯叶片内生细菌,根据内生细菌的形态特征和16S rDNA序列进行种类鉴定;通过浸叶饲喂法测定内生细菌的发酵液、发酵上清液和菌悬液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫的毒力。【结果】分别从丽薯6号和会-2叶片中分离获得对马铃薯块茎蛾3龄幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)QL1和带化红球菌(Rhodococcus fascians)YH2。分别用浓度为1.5×109CFU/mL的菌株QL1和YH2发酵液饲喂马铃薯块茎蛾3龄幼虫后第7 d时,其幼虫累积死亡率分别为81.67%和65.00%,LT₅₀分别为3.03和5.58 d;菌株QL1发酵液处理后第3、5和7 d马铃薯块茎蛾3龄幼虫的LC₅₀分别为7.99×108、3.21×106和2.73×103CFU/mL;菌株YH2菌体无明显致死效应。在1.5×109CFU/mL浓度下,菌株QL1和YH2发酵液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫的杀虫活性高于发酵上清液和菌悬液。菌株QL1和YH2的发酵液、发酵上清液、菌悬液处理后马铃薯块茎蛾3龄幼虫的累积死亡率均随着处理时间变长而逐渐升高。【结论】马铃薯叶片内生细菌苏云金芽孢杆菌菌株QL1和带化红球菌菌株YH2的发酵液、发酵上清液、菌悬液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫均具有杀虫活性,可作为马铃薯块茎蛾生防制剂开发的潜力菌株。     

一株琼脂粉降解细菌的分离

用画线接种的方法把58株从堆肥中分离的细菌接种于只含琼脂粉和水分的平皿上,室温培养数天后发现有1株细菌(BR5-1)能明显长出菌落。用这株细菌接种于含琼脂粉(2、8g·L-1)的无菌水悬液以及对照生理盐水和LB中,摇床培养48h后稀释倒平皿测活菌数。结果表明,活菌浓度在含琼脂粉的液体中(6.5×103、6.0×103cfu·mL-1)明显比在对照处理生理盐水(6.1×102cfu·mL-1)中高,但是明显比在对照处理LB培养基(1.1×108cfu·mL-1)中低。试验表明这株菌能够降解琼脂粉。     

灯盏花产黄酮内生真菌的筛选及其产黄酮能力的初步研究

通过黄酮类物质特异颜色反应和可见分光光度法,筛选产黄酮的灯盏花内生真菌,研究灯盏花产黄酮内生真菌在PDA和查氏培养基上的产黄酮能力。结果表明,28株灯盏花内生真菌中,7株菌的镁粉+浓盐酸、氯化铝、浓氨水3种颜色反应均呈阳性,能够产生黄酮。灯盏花产黄酮内生真菌的生长、菌丝体黄酮含量和产量在PDA培养基上均高于在查氏培养基上。7株灯盏花产黄酮内生真菌中,菌株ELF3-1和ERF3-1的生长较好,菌株ELF′3-1、ELF3-2和ERF3-1菌丝体黄酮含量较高,菌株ERF3-1菌丝体黄酮产量最高。     

黄瓜种子及幼苗内生细菌分离鉴定

分离不同品种黄瓜种子和幼苗中内生细菌,共得到79个菌株,经鉴定分属于芽孢杆菌属、土壤杆菌菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属及短小杆菌属。内生细菌数量测定表明,不同组织中内生细菌的数量不同,根中最多,平均含量2.63×105CFU/g鲜组织,其次为茎,再次为子叶,种子中较少;品种间内生细菌优势种群结构相同,但细菌数量略有不同。     

棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选

对不同品种和不同种植地区的健康棉花植株组织中内生细菌进行分离,共得到102个菌株.经鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单孢菌属(Xanthomonas sp.)、假单孢菌属(Pseudomonas sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)及短小杆菌属(Curtobacterium sp.),其中芽孢杆菌的分离频率最高,为优势种群.对内生细菌数量测定表明,棉花种子、根、茎、叶柄、叶片等组织内均存在大量的内生细菌.不同品种、组织及种植地,内生细菌的数量不同.各组织中内生细菌的种群密度的分布特点是种子中最多,其次为根,再次为茎,叶片、花蕾,叶柄中最少.从87个棉花内生菌的分离菌株中筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株22个,占菌株总数的25;;15株对立枯丝核菌有抑制作用,占菌株总数的17;.15株对两种病原菌都有抑菌作用,其中有些菌株表现出较强抑菌活性,具有作为生防菌的潜能.     

内生枯草芽孢杆菌E1R-J发酵条件的优化

细菌E1R-J是一株对小麦全蚀病、小麦白粉病和小麦条锈病有拮抗作用的小麦内生芽孢杆菌,笔者对其产菌的发酵培养条件进行了初步研究.发酵培养基为酵母粉0.6%,蛋白胨0.6%,NaCl 0.3%,K2HPO40.02%.最佳发酵条件为pH 4.5～9.0,菌株都可以生长,转速150 r/min,温度34℃,种子液的接种量为2%,通气量是空气与培养基的比例2:5,最佳种子液菌龄是20～34 h,作为生防用菌最佳菌龄为48～73 h.在以上条件下,细菌的发酵产量最大,细菌浓度为5.2×107cfu/mL左右.     

Detection of indigenous endophytic bacteria in <Emphasis Type="Italic">Eucalyptus urophylla in vitro</Emphasis> conditions

The presence of indigenous endophytic bacteria in aseptically grown seedlings of Eucalyptus urophylla germinated from surface sterilized seeds was investigated using dilution plating, microscopy, and PCR detection. No culturable endophytic bacteria could be detected in suspensions of ground plant tissue incubated on solid or in liquid cultivation media. However, a large number of endophytic bacterial cells, mostly rod-shaped and measured 2–3 μm×0.5–0.8 μm, were observed in in vitro cultured seedlings of E. urophylla using both light and electron microscopy. Using the universal bacterial 16S rDNA primers, a predicted 190-bp fragment was amplified from total DNA isolated from the seedlings of E. urophylla. We concluded that the endophytic bacteria originated from the seed were present in seedlings of E. urophylla. However, the bacterial cells observed appeared to be nonculturable.