利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增.结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299 bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号.与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌.     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

应用免疫分离法检测玉米细菌性枯萎病菌的研究

免疫分离法结合屯常规分离方法和血清学反应的特点。它是通过包被在固相载体上的已知抗血清与样品中的抗原发生特异性的结合，使之被中附在载体之上，加培养基后，经培养得到所需病原菌，达到分离检验的目的。试验表明，该法具有灵敏度高，特异性强，结果准确可靠，耗时短的特点，适合在口岸植物检疫中应用。     

香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan 探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高，可以快速、直接检测植物病原菌的方法，将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据该细菌与其他细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测．结果表明：只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生．检测的灵敏度为10^4CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到．相对灵敏度为10^7CFU／mL，而且整个检测过程只需2h，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染．     

一步双重PCR检测香蕉枯萎病菌

摘要：通过设计尖孢镰刀菌ITS区特异引物PR1/PR2和SCAR特异引物ST1/ST2,优化检测体系中反应参数,建立了双重PCR检测香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种的方法。结果表明：引物PR1/PR2和ST1/ST2能明确鉴别香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种,检测体系的最佳退火温度为56 ℃,检测灵敏度的最低起始DNA为20 ng。     

黄栌枯萎病菌巢式PCR检测方法的建立

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄栌(Cotinus coggygria)枯萎病可造成黄栌大量死亡,严重威胁北京香山公园的红叶景观.建立快速、高灵敏度的黄栌枯萎病菌(V.dahliae)检测技术对于黄栌枯萎病的防治具有重要意义.基于大丽轮枝菌特异性引物P1/P2扩增出的ITS序列设计3对巢...     

应用巢式PCR检测葡萄根癌病菌

为建立葡萄根癌病菌的分子检测方法,应用细菌核糖体基因间隔片段(16S～23S ribosomal DNA intergenic spacer,ITS)通用扩增引物1405f/456r和葡萄根癌病菌ITS特异引物fI/rI,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对2株葡萄根癌病菌[即葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)]和10株非葡萄根癌病菌进行扩增,并且对接种葡萄根癌病菌的匍萄植株进行检测.结果表明,仅有葡萄根癌病菌能扩增出1条长度为607 bp的片段;巢式PCR检测方法可从接种15 d后的葡萄植株中特异性检测出病原菌,而病症的出现需要30～35 d的时间.说明该研究建立的巢式PCR方法可用于快速检测葡萄根癌病菌.     

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac）,为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon,WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2）,4 μL dNTP （D4030RA,2.5 mmol?L-1）,引物（5 μmol?L-1）各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶（DR001B,5 U?μL-1）,通过退火温度优化,反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1 μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%-0.5%时,nested-PCR阳性检测率为66.7%;当种子带菌率为1%-10%时,nested-PCR的阳性检测率为83%-100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高。     

玉米细菌性枯萎病菌荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立与应用

[目的]建立一种快速、灵敏、特异的玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewarii)重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法.[方法]以玉米细菌性枯萎病菌pstS-glmS基因序列作为靶标序列,设计、合成荧光RAA检测引物和...     

玉米细菌性枯萎病和玉米内州萎焉病的酶联免疫—实时荧光PCR检测

针对玉米细菌性枯萎病和玉米内州萎焉病这两种检疫性病菌进行酶联免疫—实时荧光PCR检测研究,对该方法进行了特异性、灵敏度以及实际样品模拟试验。结果表明,该方法具有较好的特异性,检测低限在100~200 cfu·mL-1,同时可用于实际样品的检测鉴定。     

应用巢式PCR检测黄瓜尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumbrum)

文章应用BIK2/BIK3和BIK1/BIK4两对引物,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对镰孢菌属26个菌株(代表了6个镰孢菌种)以及从黄瓜根际分离的20株真菌、6株细菌和7株放线菌共计59个菌株进行了扩增。结果显示,只有3个黄瓜尖镰孢菌的致病菌株能产生一条长度大约为800bp的片断。对接种黄瓜尖镰孢菌的黄瓜植株进行检测结果表明,巢式PCR能从接种5d后的黄瓜病样中特异性地检测出病原菌,而症状的出现需要10～13d时间。该项技术具有较高的灵敏度,适用于黄瓜枯萎病早期侵染检测研究。     

番茄溃疡病一步法快速检测技术研究

对番茄细菌性溃疡病菌进行种子带菌的模拟检测试验.对用菌液处理过的种子进行简单抽提和纯化,不经过DNA提取而以抽提和纯化的病原菌为模板直接进行一步法PCR检测,对纯菌液Direct-PCR 最低检出限为2 600个细菌/ml,而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml;对种子提取液,Direct-PCR不能检出,而Nested-PCR最低检出限可达到3×105个细菌/ml.一步法Nested-PCR可在12 h内对番茄种子携带的番茄溃疡病菌进行准确的定性鉴定.并且方法方便快速,成本低,灵敏度高,适用于种子携带番茄溃疡病菌的快速鉴定.     

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

青海省山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测(摘要)(英文)

[目的]调查山羊传染性胸膜肺炎在青海省的流行状况。[方法]利用山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝试剂盒对青海各地区的208份山羊血清进行检测。[结果]山羊血清阳性率为16.3%,不同地区山羊的阳性率范围为6.7%～24.3%。[结论]青海地区的山羊支原体山羊肺炎亚种的感染率较高,应该加强对该病的防控。     

青海省山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测

[目的]调查山羊传染性胸膜肺炎在青海省的流行状况。[方法]利用山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝试剂盒对青海各地区的208份山羊血清进行检测。[结果]山羊血清阳性率为16.3%,不同地区山羊的阳性率范围为6.7%～24.3%。[结论]青海地区的山羊支原体山羊肺炎亚种的感染率较高,应该加强对该病的防控。