转录调控基因GmLEC1的cDNA克隆及其植物表达载体的构建

以高油大豆中豆32 开花后30 d的种子为材料,根据已报道的拟南芥脂肪酸合成相关转录因子LEC1序列设计简并引物,采用同源序列法从大豆种子中分离了大小为850 bp的cDNA片段,测序结果表明,该片段与拟南芥中已克隆的脂肪酸合成基因高度同源,包含完整的读码框,采用酶切连接和gateway技术构建了该基因的超量表达和RNAi植物表达载体.为借助农杆菌介导法将LEC1基因转化到大豆再生植株中,对分离的LEC1基因进行功能验证,培育高油大豆新品种奠定了基础.     

牡丹PsMDH基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹苹果酸脱氢酶基因cDNA全长,命名为PsMDH,GenBank登录号为HQ449567.其cDNA全长1283 bp,包含80 bp的5′非编码区、203 bp的3′非编码区和一个长度为999 bp编码332个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进...     

大豆抗病基因同源序列的克隆与分析

本研究根据已知抗病基因的NBS保守序列区设计4对简并引物和1对特异引物，以大豆农家种兴县灰布支黑豆为材料，应用PCR方法获得了11条来自基因组DNA的RGA序列和2条来自cDNA的RGA序列，序列长度在500—633bp之间，其中8条来自基因组DNA和2条来自cDNA的RGA序列已在GeneBank登录(登录号为：AF305388—305392，AY008380—008382，AY048863-AY048864)。13条序列都不同程度的含有NBS保守区的P-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及跨膜区GLPL等特征序列结构，由此推导出的氨基酸序列同已知抗病基因L6、RPMl、SRPS2、N编码的氨基酸序列表现出从25％——42％的同源性。本研究克隆的RGA序列根据其相似性可分为4组，与已发表的大豆抗病类似基因(RLG)具有较高的相似性。     

植物抗病基因研究进展

分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，为植物抗病基因的克隆奠定了坚实的基础。近40个植物抗病基因结构与功能的明确，有利于深入研究病原菌与寄主之间的相互作用关系，制定更为有效的植物病害防治措施。本文对植物抗病基因的克隆策略、结构与功能、抗病分子机制，以及植物抗病基因在转基因分子育种中的应用前景进行了综述。     

苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。     

玉米ZmPT6基因的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法分别从玉米郑单958基因组DNA及RNA中克隆了菌根共生磷酸盐转运蛋白基因ZmPT6,序列分析表明,ZmPT6基因全长cDNA 1 665 bp,包括一个长97 bp的内含子;编码554个氨基酸,属于Pht1家族成员,由12个疏水的跨膜结构域组成.并构建了35S启动子驱动的植物正义、反义及RNAi表达载体,为下一步玉米的遗传转化及ZmPT6基因的功能研究奠定了基础.     

香稻PRO基因的克隆及表达载体的构建

利用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因.DNA序列分析表明,所获得水稻的PRO cDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸.该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似.为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定.     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。     

番茄ACC氧化酶基因cDNA的克隆及三种植物表达载体构建

乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶.通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径.本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNAi表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中.     

紫杆柽柳cDNA文库构建与硫氧还蛋白基因的克隆

以NaHCO3胁迫的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)为材料建立了cDNA文库。经检测,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段的长度在0.3~3.0kb之间,平均长度为1.2kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu/ml。对文库克隆进行随机测序,获得了紫杆柽柳的硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因序列。生物信息学分析表明获得的硫氧还蛋白基因全长683bp,其中5'非翻译区长56bp,3'非翻译区长204bp,开放读码框长423bp,编码140个氨基酸,蛋白的分子量为15.1kD,理论等电点为5.59,其氨基酸序列中具有硫氧还蛋白的保守活性位点“WCGPC”序列,Clustal分析表明该硫氧还蛋白与蓖麻(Ricinuscommunis)的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性高,达65%。本研究构建的cDNA文库为柽柳基因克隆和系统研究柽柳抗逆分子机理奠定了基础。     

苦瓜MAP30基因的克隆与载体构建

首先提取苦瓜的基因组DNA,然后根据Genbank中已公开发表的MAP30序列,设计一对特异引物MAP301,MAP302,并增添特异定位于内质网的小肽Kozak序列。采用PCR技术,从苦瓜的基因组DNA中扩增出一分子量为800bp左右的片段,回收克隆测序,结果表明,克隆获得片段与已公开发表的MAP30序列同源性达100%,将阳性克隆进行酶切,获得的目标片段与用同样酶切所获得的植物表达载体pEV1和pEV2大片段连接,酶切鉴定重组子构建成特异表达于果实的载体。