猪繁殖与呼吸综合征病毒A06株单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)A06株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合.经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D12、4E10、6E2和7G6.其细胞培养上清效价分别为1:256、1:512、1:512和1:256,小鼠腹水效价分别为1:1.024×106、1:2.048×106、1:1.024×106和1:2.048×106.亚型鉴定表明,3D12、4E10、6E2和7G6分别为IgG2b、IgG2b、IgG1和IgG2a.ELISA检测结果显示,4种PRRSV单克隆抗体仅与PRRSV反应,不与其他病毒反应,表明均为抗PRRSV的型特异性单克隆抗体.对单克隆抗体腹水液进行IgG提取纯化,SDS-PAGE电泳验证,仅出现两条清晰条带,无杂带出现,证明纯化效果较好.这4种单克隆抗体的获得,为建立PRRSV检测方法提供了强有力的工具.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研制

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JYC株全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,融合后经间接ELISA进行杂交瘤筛选,共获得4株能分泌针对PRRSV单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,分别命名为2G7、6G7、7F2和7E8,其亚类均为IgG1;单抗腹水的间接ELISA效价分别为10×215、10×211、10×215、10×214;间接ELISA试验结果表明,4株单抗与实验室保存的江苏地区临床分离的12株PRRSV以及VR-2332均发生特异性反应,而与猪常见其他病毒如猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪圆环病毒2(PCV2)均无反应性;间接荧光试验表明,4株单抗与Marc-145细胞感染的PRRSV均呈特异性的荧光反应。因此这些单抗均可用于ELISA方法以及间接荧光试验,从而为建立快速、敏感的PRRSV的抗原检测方法奠定了基础。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的PRRSV全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得2株能稳定分泌抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为3C3、3D2,经鉴定亚类均为IgG2a、kappa链。2株单克隆抗体腹水ELISA效价达105～107,IPMA效价达1:2560～1:10240,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体,为研究该病的快速诊断技术奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备

用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体（McAb）,经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSVN蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-蛋白与GST—N蛋白两种抗原包被的ELIA反应均为阳性。5F9与HIS—N蛋白包被的ELISA反应为阳性,而与GST—N蛋白包被的ELISA反应呈阴性。单抗1A12,3F11,4E4,5A3与HIS-N与GST—N蛋白的Western blotting反应均为阳性,而5F9只与HIS-N反应。IFA检测显示1A12,3F11,5A3,4E4株单抗都有明显的荧光,说明其与PRRSV呈阳性反应。同时,ELISA检测又有很好的特异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

采集临床疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料,经处理后进行细胞培养、电镜观察、半数细胞感染量测定、间接免疫荧光试验、动物回归试验以及RT-PCR检测,分离到1株病毒。分离株在Marc-145细胞上连续4代后出现特异性细胞病变;电镜观察到直径50~80 nm的病毒粒子,有囊膜;TC ID50为10-4.7/0.1 mL;与美洲型PRRSV阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光;RT-PCR检测结果为阳性;回归40日龄血清阴性仔猪可出现PRRSV感染的典型临床症状和病理变化,并且可检测到血清中的特异性抗体。结果表明分离株为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏株的分离与鉴定

从暴发猪高热病的江苏盐城地区某养殖户送检病料中分离到一株致Marc-145细胞病变的病毒,细胞培养物裂解上清经浓缩、负染后电镜观察可见直径约50 nm,有囊膜的球形病毒粒子;间接免疫荧光试验结果表明,该分离株与美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清反应发出强特异性荧光;以特异性引物对分离的病毒进行RT-PCR扩增于600 bp～700 bp出现单一条带,序列分析显示Nsp2缺失了87 bp.结果表明,该分离株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,暂命名为JYC.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1a株的GP3蛋白基因进行截短修饰后,克隆于pGEX6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGE检测,融合表达的蛋白rtGP3大小约40 000;Western blotting分析证实,表达的融合蛋白rtGP3能被PRRSV阳性血清所特异性识别。收获融合表达的rtGP3,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以表达的融合蛋白rtGP3和GST蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,结果获得了5株能稳定分泌抗rtGP3蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为31A2,31G11,32B12,32D4和32H7。利用PRRSV感染的Marc-145细胞进行间接免疫荧光检测显示,所获得的5株单克隆抗体均能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果表明,5株单克隆抗体均为IgG1型,且轻链均为κ链。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白单克隆抗体,首先构建猪PRRSV GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,将其作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫4次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建PRRSV GP5基因的原核重组表达载体pGEX-6P-GP5,将其转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原,通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。本研究成功构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,表达并纯化了GP5蛋白。经2~3次亚克隆后获得3株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株,IFA和Western blot对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-6.5TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单克隆抗体的制备及生物学特性研究

通过差速离心和蔗糖密度梯度了心法对猪繁殖与呼吸综合征病毒沪1（PRRSV－S1）株进行抗原纯化。免疫BAIB／c小鼠，取脾细胞与SP2／O融合，用间接ELISA和有限稀释法,获得2株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为AG、BD3。ELISA交叉试验和阻断试验表明，2株单抗具有高度特异性。AG1可与PRRSV－S1，欧洲株LV，美洲株VR－2332反应，而BD3与美洲株VR－2332反尖较弱，2株单抗对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价是：1：256－1：5123，腹水效价分别在1：10^3－1：10^5之间。AG1和BD3各有100条染色体，琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b，BD2属于IgM。Western blot试验表明AG1和BD3是针对N蛋白抗原表位的特异性单抗。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。     

猪生殖——呼吸综合征病毒研究进展

对猪生殖与呼吸综合征病毒新的分类地位,基因结构特点,病毒蛋白的功能、病毒在细胞的增殖过程,增殖特点、毒株变异等新进展及病毒独特的生物学行性作了综述,提出了病毒变异和毒力差异的分子基础是需要进一步研究的问题。     

家蝇体内猪繁殖与呼吸综合征病毒的初步分离与鉴定

为调查养猪场环境中家蝇携带猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)情况,2010年采集贵州某猪场家蝇样本,采用RT-PCR方法筛选阳性样本,接种Marc-145细胞分离培养病毒,对分离获得的家蝇样本的PRRSV Nsp2基因进行克隆和序列分析。针对PRRSV N基因家蝇样本扩增出377 bp的特异性片段,阳性家蝇样本接种的Marc-145细胞出现明显CPE现象,针对PRRSV Nsp2基因细胞培养物扩增出1064 bp的特异性片段,测序结果显示,家蝇样本的细胞培养物的PRRSV Nsp2基因片段与贵州猪场猪源PRRSV流行株相比具有较高的核苷酸同源性,高达97.1%~98.5%。从而初步推断家蝇也可能成为PRRSV携带者。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

为研制特异性敏感性较好的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测和诊断,将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到p ET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内实现了高效表达,表达形式为可溶性表达,通过Western blot证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性。将大肠杆菌表达的N蛋白经过超声、离心、过柱纯化后,作为间接ELISA包被抗原检测血清中的PRRSV抗体,通过对各参数和试剂的优化建立了能检测PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法;对方法的特异性和重复性以及与同类成品试剂盒间的应用效果对比进行了试验。结果表明,研究建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中PRRSV抗体、监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

华南地区猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析

为了解华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的最新流行情况,采集了华南地区11个规模猪场各饲养阶段猪血清807份,用套式PCR(nPCR)检测猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2);采集了若干猪场2010年1月至2011年8月期间有咳嗽、喘气、消瘦及疑似PDNS等临床症状的猪血清312份,以及无临床症状猪血清104份,以nPCR检测PCV-2,以一步法反转录PCR(RT-PCR)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒.结果发现,所调查的11个规模猪场中只有5个检出PCV-1,所有猪场均检出PCV-2.PCV-2阳性率为30.61％,而PCV-1阳性率仅为4.21％;经产母猪和7周龄以上保育猪PCV阳性率最高;有临床症状的猪血清PCV-2阳性率为58.65％,PRRSV阳性率为37.82％,PCV-2阳性猪群中有39.89％的猪同时感染PRRSV;有症状猪群7月～9月的PCV-2感染率最高,而1月～3月最低;无临床症状猪血清PCV-2阳性率为27.9％,PRRSV阳性率为0.96％,PCV-2与PRRSV无混合感染.证明PCV尤其是PCV-2在华南地区仍广泛传播并流行,而且PCV-2与PRRSV混合感染致病情况较多.PCV-2的感染率与季节有一定的相关性,种猪带毒情况严重.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核衣壳蛋白编码基因序列设计了一对特异性引物P1／P2。扩增出大小为294bp的目的片段；再针对这个基因片段。设计合成4条寡核苷酸探针。其中反向引物的5’端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础。通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测。建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测。与RT—PCR检测方法相比。本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明用该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的，对该病的进行快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。