水稻ISA1基因的克隆与分析(英文)

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,胚乳总RNA提取参照Bioteke公司植物多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书,用琼脂糖凝胶和Nano-drop检测RNA纯度和浓度。完整性和纯度较好的RNA样品逆转录合成cDNA第1链。根据已发表的水稻ISA1基因序列设计引物IsoaF1和IsoaR1,用于扩增包含全长ORF在内的ISA1cDNA序列。利用TakaraLAPCR试剂在25μl的体系中进行PCR反应。目标片段经切胶回收后连接到pGEM-Teasy载体,转化后进行测序鉴定。利用DNAstar进行序列分析和同源性比对,基因结构与染色体定位分析采用Gramene数据库,核酸和蛋白质序列BLAST检索采用NCBI数据库。利用ClustalW比对和NJ方法在MEGA4中构建系统进化树。利用半定量RT-PCR分析ISA1基因在水稻不同组织(叶、根、茎和胚乳)以及在不同灌浆期胚乳(灌浆3～24d)中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基ISA1基因位于第8号染色体,由18个外显子组成;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～82.5%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

紫甘蓝COP1基因的克隆及表达模式分析

光照是植物生长发育的一个重要的环境因素,COP1是光调控植物发育的一个分子开关。本实验以"早红"紫甘蓝为实验材料,分两组置于光照(光照16h,28℃;黑暗8h,18℃)及完全遮光培养箱培养,至幼苗时提取RNA,进行COP1的cDNA克隆,并通过半定量RT-PCR方法分析COP1在不同处理下的表达情况。结果表明:COP1 cDNA全长为1863bp,编码620aa,分子量为70.325kD;在无光条件下生长的紫甘蓝幼苗虽然仍有少量花青素合成,但是其花青素含量明显低于光照条件下生长的紫甘蓝幼苗;COP1基因在无光条件下的表达量明显强于有光条件,表明COP1对紫甘蓝中花青素的合成起负调控作用。本文旨在探索在不同光照条件下紫甘蓝中COP1基因与其花青素合成的关系,为后期揭示花青素表达调控机制奠定基础。     

水稻L-半乳糖脱氢酶基因的克隆与序列分析

[目的]对水稻L-半乳糖脱氢酶（L-GalDH）基因进行克隆与序列分析。[方法]通过RT-PCR从水稻中克隆了L-GalDH基因,采用GenBank的BLAST程序进行序列分析。[结果]水稻L-GalDH基因的cDNA全长1 340 bp,包含一个长为951 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与其他植物的L-半乳糖脱氢酶基因的同源性较高,其中与大麦的同源性最高,序列一致率为92%,与菠菜的序列同源性稍低,一致率为71%。系统进化分析结果表明不同来源的L-GalDH基因聚为3类。[结论]该研究为L-GalDH基因的功能研究打下了基础。     

水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

山羊子宫中LHR基因片段的克隆及半定量RT—PCR检测方法的建立

【目的】进一步研究处于发情周期不同阶段的济宁青山羊子宫中黄体生成素受体(LHR)mRNA表达量的变化,为探讨其对山羊生殖内分泌机制的作用规律提供理论依据。【方法】以GAPDH为内参照基因,从济宁青山羊的子宫组织中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增目的基因,进行克隆测序,并对半定量RT-PCR反应体系进行了优化。【结果】获得了济宁青山羊LHR mRNA的部分序列,长度约为286 bp,与已报道的GenBank中羊的LHRmRNA(序列号为AF379199)41~326 bp序列同源性为100%。以此基因片段的阳性克隆为基础优化的半定量RT-PCR体系为:LHR基因的适宜循环数为30个,内参照GAPDH基因的循环数为26个,Mg2+浓度均为1.5 mmol/L。【结论】克隆了山羊LHR mRNA的部分序列,并建立了优化的半定量RT-PCR体系。     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA 1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

果蔗SoSgt1基因的克隆表达与植物反义表达载体的构建

利用不同作物的Sgt1基因的SGS保守区域的氨基酸保守位点设计简并引物,从果蔗的cDNA中克隆分离出果蔗SoSgt1基因片段。以果蔗SoSgt1基因片段为探针,利用电子克隆和序列拼接方法并通过RT-PCR验证获得了一个全长1438bp的cDNA序列。通过ORF软件分析,预测得到的蛋白质具有362个氨基酸。利用NCBI数据库中的Protein Blast分析SoSgt1蛋白氨基酸序列,得出含有SGT1蛋白的3个典型的保守结构域(TPR,CS和SGS),与其他作物的SGT1蛋白比较具有较高的相似性。利用梢腐病病原Gibberella fujikuroi接种福安果蔗叶片,检测到SoSgt1基因的转录水平逐渐提高,并用果蔗SoSgt1基因的cDNA片段设计2个酶切位点,反向插入到植物真核表达载体pCAMBIA1301,构建反义表达载体pCAM-SGT。     

植物抗病性信号传导调控基因的克隆与表达检测方法的研究

建立了从不同植物中克隆抗病性信号传导调控基因及检测其表达的方法，并优化了相关条件。用RT-PCR和PCR方法从拟南芥、烟草、番茄、中华鳖中克隆了7个信号传导通路中18个调控基因的cDNA和DNA序列，它们分别是：抗病基因Pto介导的蛋白激酶级联中的Pti4、Pti5和Pti6，细胞编程死亡通路中的Hinl和hsr203，水杨酸介导的系统性获得抗病性通路中的NPRI，乙烯信号通路中的ETRl、ERSl、CTRl、EIN2和ERFl，茉莉酸信号通路中的CO/1，核黄素信号通路中的RFBP和LR，脱落酸信号通路中的ABF3、ABF4和ABHI，以及调控不同信号通路的通调基因NDRl。进一步研究了这些基因表达的定量测定方法：用细菌激发子harpinE4处理植物，提取RNA作为cDNA第1链合成的模板，以在真核生物中广泛同源和高度保守的细胞伸长翻译因子基因EFlα为内参，用半定量RT-PCR法测定基因mRNA的积累，可以比较准确地检测不同基因的相对表达水平。     

小菜蛾三个普通气味受体基因的克隆及表达谱

【目的】克隆小菜蛾（Plutella xylostella）触角中3个气味受体基因,明确这3个气味受体在不同组织中的表达分布,进而推测这3个基因的功能,为进一步深入研究奠定基础。【方法】通过新一代高通量测序技术对小菜蛾成虫触角进行转录组测序,获得小菜蛾的转录组数据信息,通过对高质量序列的拼接组装、基因鉴定和功能注释,并通过Blastx基于数据库进行相似性比对分析,预测小菜蛾的气味受体候选基因;设计引物通过克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,并利用半定量RT-PCR研究其在雌、雄成虫9个不同组织中的表达。【结果】根据预测的基因序列,设计特异引物,克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,分别命名为PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18（GenBank登录号分别为KF717601-KF717603）。PxylOR16开放阅读框全长为1 218 bp,编码406个氨基酸;PxylOR17开放阅读框全长为1 200 bp,编码400个氨基酸;PxylOR18开放阅读框全长为 1 191 bp,编码397个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）的气味受体,以及已报道的小菜蛾的6条性信息素受体与1条非典型气味受体与本实验克隆得到的3个气味受体进行序列比对和进化树分析,结果显示这3个气味受体基因与非典型气味受体和性信息素受体同源性低,而与其他的普通气味受体聚类在一起,且PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18彼此同源性较低。半定量的结果显示,3个普通气味受体基因均在触角中表达量最大,在其他嗅觉感器,如喙、下唇须和头部中也有一定量的表达,雌、雄间无显著差异。另外,PxylOR17在雌蛾生殖器中,PxylOR18在雌蛾腹中也有一定表达。但3种气味受体基因在雌、雄蛾的胸、足和翅等组织中均不表达。【结论】鉴定和克隆了3个小菜蛾气味受体基因,明确这些气味受体基因在小菜蛾不同组织中的表达水平,通过进化树分析、序列比对和组织表达谱分析确定PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18为3条普通气味受体,且在功能上高度分化。根据半定量RT-PCR的结果,推测这3个基因可能参与了普通气味分子的识别过程,此外PxylOR17和PxylOR18还可能参与了信息素的产生和释放过程。     

水稻盐胁迫相关基因sos 5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%.     

水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。     

7个水稻线粒体tRNATrp突变体的克隆和活力测定

为了研究tRNAs被相应的氨酰酶识别的种属特异性,构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp 3个碱基（G73,U72,A68）的单点或多点突变的突变体．突变基因,经体外转录后分别用枯草杆菌（B．subtilis）和人色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）进行氨酰化反应,并测定动力学常数．结果表明：与野生型水稻线粒体tRNA^Trp相比,7个突变体的转录产物被B．subtilis TrpRS氨酰化的活力分别下降了53．33％～99．79％;被人TrpRS氨酰化的活力则提高了4～330倍,其中以pMPH7的氨酰化活力改变最大．识别位碱基G73,G1／U72,U5／A68对水稻线粒体tRNA^Trp的种属特异性识别起重要作用．     

水稻根系发育基因OsKSR7 的克隆与功能分析

【目的】 水稻根系是与地上部性状和产量密切相关的重要农艺性状。通过鉴定新的水稻根系发育相关基因,为深入解析水稻根系发育遗传机理奠定基础。【方法】 从甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选到1个根系发育缺陷的突变体Osksr7 （Oryza sativa kasalath short root 7 ）。通过溶液培养和田间种植,对该突变体进行苗期表型鉴定及成熟期主要农艺性状考察。将Osksr7 分别与野生型籼稻Kasalath和粳稻Nipponbare杂交,F₂群体进行遗传分析和突变基因的图位克隆,对预测的候选基因进行测序验证。构建由35S启动子驱动OsKSR7 的回复载体,通过农杆菌介导转入突变体成熟胚诱导的愈伤组织进行转基因互补验证。【结果】 与野生型相比,Osksr7 幼苗期的主根、不定根、侧根和根毛的伸长都受到抑制,主根、不定根和侧根的长度分别只有野生型的33%、38.9%和35.3%,但不定根数有显著增加。农艺性状调查发现,Osksr7 的株高、穗数、茎秆粗细、结实率、千粒重和剑叶长宽等性状都受到显著影响,其中,穗数和结实率的差异极显著,分别只有野生型的56.3%和37.3%。遗传分析表明,突变体Osksr7 和籼稻Kasalath杂交的F₁表型正常,F₂群体中正常植株与短根突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体Osksr7 的突变性状受1对隐性核基因控制;利用SSR和InDel分子标记将突变基因定位在水稻第11染色体上IND1与IND2之间,物理距离约为143 kb的区间。在该区间有25个预测注释基因,候选基因测序比对发现,突变体Osksr7 中的一个编码转运蛋白的基因LOC_Os11g24560 第一个外显子上ATG后73 bp处的T突变为A,导致编码的第25位氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。生物信息学分析表明LOC_Os11g24560 是介导蛋白质从内质网（ER）运向高尔基体（Golgi）的COPII有被小泡的SEC23亚基在水稻中的同源基因。RT-PCR表明LOC_Os11g24560 的表达水平在野生型和Osksr7 突变体中无显著差异,35S启动子驱动的LOC_Os11g24560 的回复载体能够使Osksr7 突变体的表型回复成野生型,证实Osksr7 的表型是由LOC_Os11g24560 突变引起。【结论】 Osksr7 是一个水稻短根突变体,其产量相关的几个重要农艺性状显著受抑制,突变基因为LOC_Os11g24560 ,编码COPII有被小泡的SEC23亚基,与已报道的水稻根系基因都不等位,是一个新的水稻根系发育调控基因。     

水稻PIN家族的生物信息学分析

作为植物中最重要的生长素外输载体,PIN家族在各种植物中都拥有众多成员。对水稻基因组的BLAST搜索获得了12个PIN家族成员,分析发现:水稻PIN基因不均衡地分布在基因组染色体上;其内含子、外显子结构类似;PIN蛋白质拥有典型的载体蛋白序列特征,即亲/疏水性反复变化,存在多次跨膜结构域;几乎所有PIN蛋白都有一个NPNXY的内化结构域和7个功能未知的基序;PIN在早期即分化为两组成员,主要区别在于中间亲水环的部分缺失;并且在后来发生了支系特异的复制事件,从而形成了众多旁系同源基因。     

水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展

 稻瘟病是全世界范围内影响水稻粮食生产的主要病害之一。培育和合理利用抗病品种是控制稻瘟病最经济、有效的措施。随着水稻（Oryza sativa）及稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）基因组测序的完成,水稻-稻瘟病菌的互作已成为研究植物与真菌相互作用的模式系统。在过去的50多年中,通过广泛的遗传分析,已经鉴定了84个稻瘟病抗性基因及大量的数量抗性遗传位点（quantitative trait locus）。其中,8个主效抗性基因及1个隐性部分抗性基因已被克隆。本文综述了迄今已鉴定及定位的稻瘟病抗性基因的研究情况,根据基因的定位信息将这些基因整合到一张连锁图谱中;对抗性基因簇以及簇内基因间的关系作了分析;并进一步对后基因组时代抗性基因克隆策略的变化及其对策进行了探讨。     

一个水稻生物产量突变体的遗传分析

突变体是研究基因功能的重要材料。除自然突变和物理、化学方法外,T—DNA插入诱变、转座子插入诱变等分子生物学手段也得到广泛的应用。而水稻全基因组测序的完成和水稻分子标记技术发展,使得通过图位克隆法从非插入突变的水稻突变体获得相关基因变得相对容易,目前,在水稻上通过图位克隆已克隆到一些重要的基因。该研究在转Bar基因水稻后代T1代群体中发展了一个高生物产量突变体,并对该突变体进行遗传分析,为该基因的克隆和功能分析提供参考。