牛生长激素cDNA的克隆与序列分析

从平脑垂体中分离总ＲＮＡ，经ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）一纤维素柱纯化ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ技术扩增牛生长激素（ｂＧＨ）ｃＤＮＡ序列，长度为６２０ｈｐ，将ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９Ｓｍａｌ位Ⅰ点转化大肠杆菌ＤＨ５α，经蓝白斑筛选，获得重组克隆，分离重组质粒，经限制性内切酶酶切分析后，进行序列分析。结果表明，一质粒中所含克隆片段为ｂＧＨｃＤＮＡ全序列，与国外所发表的ｂＧＨ核旮酸序列基本相同     

水牛垂体催乳素cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中报道的几种哺乳动物催乳素（PRL）基因序列，设计1对特异性引物。从广西本地水牛脑垂体中提取总RNA，利用RT—PCR技术扩增水牛PRLeDNA全序列，并连接到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序，测定结果表明：该eDNA开放阅读框（ORF），长度为690bp，编码氨基酸为229个，其中前19个氨基酸为信号肽。用NCBI上的Blast功能将测序结果同GenBank已发表的序列进行比对，具有很高的同源性，其中与牛属动物同源性最高，达98．4％，证明所克隆的序列为水牛PRLeDNA全序列，已提交到GenBank（登陆号：EF054878）。本研究成功克隆水牛PRLeDNA全序列，为下一步构建原核表达载体、表达体外蛋白，以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

桃PGIP基因及cDNA的克隆及序列分析

通过PCR扩增了桃的PGIP基因及eDNA序列,并进行了序列之间的比对及分析。结果表明,桃的PGIP基因全长1092bp,而其cDNA序列只有1045bp,PGIP基因中含有一段长147bp的内含子,且内含子符合GT-AG规律。这与其他核果类植物的PGIP基因构成基本相同。其基因序列与GenBank中已登录的3个桃以及其他核果的序列比对,其同源性达92％～99％;与苹果、梨和大桉的同源性分别为85％、84％和8．4％。     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79%,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank(Accession.EF624459)。     

广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA克隆及序列分析

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3%、50.9%和49.9%.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA克隆及序列分析

为了探讨PDGFA基因的结构和功能,采用RT-PCR方法获得梅花鹿PDGFA基因,并运用生物信息学软件对其序列进行了分析。结果表明:梅花鹿PDGFA基因开放阅读框大小为591 bp,共编码196个氨基酸,蛋白的分子质量约为22 ku,理论等电点(pI)为8.53,是亲水性蛋白,具有信号肽。二级结构分析显示,含有47.45%无规则卷曲、39.29%α-螺旋、13.27%扩展链。进化分析显示,PDGFA蛋白与白尾鹿(Odocoileus virginianus texanus)、家牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)、野猪(Sus scrofa)、白犀牛(Ceratotherium simum)、小鼠(Mus musculus)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、原鸡(Gallus gallus)、绒啄木鸟(Picoides pubescens)的蛋白质序列相似度分别为98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。     

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85 kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的hLYZ cDNA序列的同源性为99%。推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础。     

水牛Cdc42cDNA的克隆与生物信息学分析

通过RT-PCR扩增得到水牛细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)cDNA序列,将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序并进行生物信息学分析.结果表明:克隆得到的序列全长626 bp,含有1个大小为576 bp的开放阅读框,共编码191个氨基酸,相对分子质量为21.3×103,理论等电点为6.1...     

红花石榴二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因cDNA片段克隆及序列分析

二氢黄酮醇还原酶(DFR)是植物花色苷生物合成途径中的关键酶。以红花石榴"泰山红"的花瓣总RNA为模板,利用简并引物,采用RT-PCR方法,扩增出一条长446 bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA片段与GenBank中的甜樱桃、葡萄等物种的DFR氨基酸同源性为78%～81%,说明该二氢黄酮醇还原酶片段为石榴花DFR基因的cDNA片段,GenBank登录号为JN316028。     

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。     

姬松茸(Agaricus blazei Murrill.)gpd启动子的克隆及其序列分析

[目的]对姬松茸中分离的gpd启动子片段进行序列分析。[方法]根据报道的gpd启动子序列设计合成1对引物,以姬松茸基因组DNA为模板,采用PCR扩增法克隆得到了2条DNA特异性片段,并利用启动子信号扫描和启动子预测程序对2条序列的片段启动子区和转录结合位点进行分析。[结果]测序结果表明,2条序列分别为372bp和614bp,分别命名为J-gpd 1和J-gpd2,GenBank登陆号分别为：EU220746和EU220747;J-gpd 1有3个,J-gpd 2有4个核心启动子区;2条序列不仅具有基本启动子作用元件CAATBOX和TATABOX外,还具有多个重要作用元件,如CGCGBOX、GATABOX、ASF-motif、W-BOX、TGACGT-motif和GTGA motif等。利用TFSEARCH ver．1．3分析表明,2条序列还舍有多个转录因子结合位点,包括GCR1、ADR1、HSF、ABF1和RAP1等。[结论]研究推测,2条序列所启动的基因具有较高的多样性和准确性。     

长丝裂腹鱼MyoD1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆长丝裂腹鱼的MyoD1基因,并对其进行序列分析。[方法]根据鲤鱼(Cyprinus carpio)的MyoD1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对长丝裂腹鱼MyoD1的全长cDNA序列进行扩增,并对该基因编码氨基酸的理化性质及同源性进行预测和分析。[结果]试验获得了包括完整ORF的长丝裂腹鱼MyoD1基因,该序列长957 bp,编码274个氨基酸,具有MRFs家族基因的典型性碱性bHLH结构;该MyoD1序列与齐口裂腹鱼、鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等的MyoD1序列同源性较高,与人、猪、牛等哺乳动物的同源性较低。[结论]该研究为长丝裂腹鱼的肌肉发育和肉质特性形成的分子机制研究提供了基础数据,同时为青藏高原冷水鱼资源的利用与保护提供了指导意义。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA,并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板,根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物,用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后,与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA,该片段长1577bp,编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异,同源性为98％;而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成,序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。