平邑甜茶新根扩展蛋白基因MhEXP1的cDNA全序列克隆及表达

【目的】对平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp）Rehd. var pinyiensis Jiang]新根扩展蛋白基因进行克隆和表达分析,为揭示扩展蛋白在平邑甜茶根系生长发育中的功能打下基础。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术克隆扩展蛋白同源基因,并通过Northern杂交研究其在不同器官中的表达情况及吲哚丁酸（IBA）的处理效应。【结果】成功地从平邑甜茶白色新根中获得了一个全长的扩展蛋白基因,命名为MhEXP1,GenBank登录号为DQ538346。MhEXP1 cDNA全长1 111 bp,含有771 bp的完整开放阅读框,编码257个氨基酸,预测分子量和等电点分别为27.8kD和8.9。序列分析表明,MhEXP1具有扩展蛋白的典型结构,即氨基酸序列N端有８个半胱氨酸残基,1个组氨酸（His-Phe-Asp,HFD）域,C末端存在4个保守的色氨酸残基。Northern杂交表明,该基因在平邑甜茶叶片中表达量很低,但在新根中大量表达并受IBA诱导,且随着IBA处理时间的延长表达量逐渐增加。【结论】成功地从平邑甜茶中克隆了一个全长的扩展蛋白基因MhEXP1,该基因在叶片中表达量很低但在新根中大量表达,并受IBA诱导;MhEXP1参与IBA调节的平邑甜茶根系生长发育。     

蜡梅金属硫蛋白基因的克隆与原核表达

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒对其进行纯化回收,得到了高纯度蛋白,为今后研究奠定基础。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1~3个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏肾脏腮脑肌肉。     

黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法克隆获得黄河鲤(Cyprinus carpio)金属硫蛋白基因的编码区(CDS)序列,该序列长183bp,编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1³个)-Cys结构,预测分子量为6013 D,理论等电点为8.38。经多序列比对,黄河鲤与高身鲫(Carassius cuvieri)的同源性最高,达94%。采用RT-q PCR进行黄河鲤MT的组织表达分析,结果表明:黄河鲤MT基因的表达存在组织性差异,其相对表达量表现为肝脏>肾脏>腮>脑>肌肉。     

水稻3型金属硫蛋白基因的分离和表达研究

[目的]对从水稻幼苗中分离的2个3型金属硫蛋白基因OsMT-I-3a和OsMT-I-36的结构进行了分析,并对其表达模式进行了检测。[方法]利用Blast搜索水稻数据库,设计引物并利用RT—PCR的方法克隆OsMT-I-3基因cDNA全长。通过多重比对等方法对其基因和蛋白结构进行了分析。利用Northem杂交对这两个基因的组织表达模式和环境应答模式进行了检测。[结果]OsMT-I-3a和OsMT-I-3b分别编码62和65个氨基酸的多肽,具有典型的3型金属硫蛋白的半胱氨酸分布模式。OsMT-I-3a基因在叶片中没有检测到表达,OsMT-I-3b在叶片中高表达,且各种非生物胁迫因素会影响两种基因的表达模式。[结论]I类3型2个水稻MT基因可能参与水稻多种环境胁迫的信号通路,在水稻抗非生物胁迫过程中起作用。     

平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆、表达及转化研究

根据GenBank上苹果GLB1基因的EST序列设计引物,利用PCR技术克隆到平邑甜茶GLB1同源基因MhGLB1（GenBank注册号：GQ423619）,该基因包含一个477bp的开放阅读框,编码158个氨基酸,分子量为17．8ku。成功构建了35S：：MhGLB1正义表达载体,并对“S以12粉”番茄进行农杆菌介导的遗传转化。荧光定量PCR结果显示,MhGLB1在根、茎、叶中均有所表达,但在根中的表达量最高;NO3-和SNP处理能够诱导根中MhGLB1的表达。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝(Ganoderma lucidum)金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3′-端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp(包括一个终止密码子),可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸(Cys)含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸(Ser)和丙氨基酸(Ala),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

一个油茶金属硫蛋白基因的克隆与序列分析

在油茶cDNA文库和EST文库构建的基础上,根据油茶金属硫蛋白的FAST序列设计特异引物,以油茶近成熟种子为材料,利用3'RACE技术,克隆到1个金属硫蛋白基因的cDNA全序列.该基因全长为675 bp,其中5'非编码区59 bp,3'非编码区379 bp,开放阅读框长234 bp,编码78个氨基酸;该蛋白含有14个半胱氨酸,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC,CX,CXXC形式排列.预测该蛋白相对分子量为7 864.9 Da;等电点为4.86;37～48位氨基酸间有较强的疏水区.多序列比对发现油茶MT核苷酸序列与茶的相似性达到99%,推导的氨基酸序列与茶完全相同,因此将该基因命名co_mtl.     

植物金属硫蛋白研究进展

植物金属硫蛋白是一类可与金属子结合的、富含半胱氨酸残基的小分子蛋白,在植物界广泛存在,可以被众多非生物因素诱导产生,其所具有的强烈的清除自由基和结合重金属离子的能力使其成为植物研究的热点。对植物金属硫蛋白的分类、基因结构与调控、结构、性质与应用、分离纯化与检测等方面的近期研究进展作简单介绍,同时提出一些研究中存在的问题,并对其研究前景进行展望。     

湖北海棠病程相关蛋白MhPR8基因的克隆与表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆植物第Ⅲ类几丁质酶基因PR8的cDNA序列和基因组DNA序列,研究化学试剂SA、MeJA、ACC、ABA,非生物胁迫NaCl和低温（4℃）,生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导下MhPR8基因的表达特性。【方法】利用PCR技术分别从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库和基因组DNA中克隆MhPR8基因全长序列;利用生物信息学方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因的表达特性。【结果】该基因编码区为897 bp,编码298个氨基酸,蛋白质分子量为31.67 kD,等电点为4.77,命名为MhPR8。该基因在其编码区内部没有内含子。MhPR8蛋白含有保守的结构域GH18_hevamine_XipI_class_III,属于第III类几丁质酶。该蛋白含有6个保守的半胱氨基酸残基,含有植物第III类几丁质酶起催化作用的天冬氨酸和谷氨酸,分别位于第151和153位氨基酸。qRT-PCR分析结果表明,该基因在湖北海棠根中的表达量最大;SA、MeJA和ACC明显诱导该基因的表达,ABA略微诱导该基因的表达;低温诱导该基因的表达,而NaCl诱导该基因的表达不明显;生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导该基因的表达。【结论】湖北海棠MhPR8可能参与SA、JA/ET介导的信号通路中,在湖北海棠抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着非常重要的作用。     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

羊口疮病毒B2L基因克隆及表达

为了获得羊口疮病毒囊膜蛋白。以羊口疮病毒基因组为模板,利用羊口疮病毒B2L基因特异性引物,进行PCR扩增,回收以及纯化PCR产物,连接到PMD18-T载体上,测序结果表明B2L基因全长1 137 bp,编码379个氨基酸。再将B2L基因克隆至p ET-30a,构建原核表达载体p ET30a-B2L。经菌液PCR、酶切鉴定以及SDS-PAGE等方法表明成功构建原核表达载体,这将为今后的单抗制备以及羊口疮病毒的疫苗研究打下基础。     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因（SoNADP-IDH）的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C₄作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆SoNADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用qRT-PCR技术研究SoNADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为SoNADP-IDH,GenBank登录号为KF808326。该cDNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,SoNADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶（IDH）蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,SoNADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫（RSD病菌）和4种非生物胁迫下低温（4℃）、干旱（PEG）、高盐（NaCl）和激素（ABA）均可影响SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,SoNADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,SoNADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,SoNADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,SoNADP-IDH表现出“抑-扬-抑-扬”的表达模式,在处理3 h时SoNADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在NaCl模拟的高盐胁迫下,SoNADP-IDH表现出“扬-抑-扬”的表达模式,SoNADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。     

家蚕5-羟色胺受体基因的克隆及表达分析

【目的】5-羟色胺（5-HT）在许多生理过程中扮演重要角色,克隆介导5-HT生理效应的家蚕5-HT受体及组织表达分析,为研究家蚕5-TH受体基因功能奠定基础。【方法】利用基因组数据及半定量real-time PCR技术,鉴定克隆4种家蚕5-HT受体基因; 应用生物信息学方法分析5-HT受体在物种间同源性并构建系统进化树; 利用半定量real-time PCR方法分析它们在幼虫和成虫不同组织的表达情况。【结果】根据预测基因序列,设计特异引物,克隆得到4种5-HT受体基因序列,分别命名为5-HT1ABm、5-HT1BBm、5-HT2Bm、5-HT7Bm（GenBank登录号KM236100-KM236103）,其开放阅读框分别为1 395、1 341、1 881和1 497 bp,可编码464、446、626和498氨基酸。4种5-HT受体属于典型的G蛋白偶联受体。选择已报道的昆虫及脊椎动物的5-HT受体氨基酸序列进行比对并系统发生树构建,结果显示家蚕4种5-HT受体间的氨基酸序列相似度仅为30.4%。5-HT1A、5-HT1B、5-HT2、5-HT7 4种受体在昆虫中的相似性分别为45.4%、61.4%、48.4%、54.1%。另外,家蚕5-HT受体与其他昆虫甚至脊椎动物有较高的同源性,跨膜区的保守性比非跨膜区高。不同物种间的同一家族5-HT受体的相似性高于同一物种内不同家族5-HT受体的相似性,家蚕5-HT受体的进化关系与烟草天蛾最近。半定量real-time PCR结果显示,5-HT1ABm、5-HT1BBm在幼虫所有组织中均有表达。5-HT2Bm仅在幼虫的头、腹部神经索、精巢表达。5-HT7Bm在幼虫头部、腹部神经索、中肠、脂肪体、精巢、卵巢表达。5-HT1ABm、5-HT1BBm、5-HT7Bm在成虫中除雌性头部以外的组织中均有表达,而5-HT7Bm在雄蛾的生殖系统中表达量明显高于其他组织。5-HT2Bm在成虫中不表达。【结论】鉴定和克隆的4种家蚕5-HT受体基因,在昆虫和脊椎动物中具有较高的保守性,与烟草天蛾同源关系最近,它们在幼虫和成虫的组织表达模式具有多样性。     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

淹水胁迫对湖北海棠叶片生理指标的影响及胁迫相关基因的表达

以湖北海棠1年生实生苗为研究对象,研究了淹水胁迫对其叶片生理指标的影响。结果表明:随着淹水时间延长,湖北海棠叶片可溶性糖、可溶性蛋白质量分数均显著高于对照组,并呈现逐步上升趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性先上升后下降,过氧化物酶(POD)先下降后上升,二者可能存在一定的补偿机制;脯氨酸(PRO)和丙二醛(MDA)含量均呈现先下降后上升的趋势。除可溶性糖外,其他生理指标的峰谷值出现的时间均为第10d,但各指标的启动时间不同,PRO与MDA在0~5d启动,SOD与POD以及可溶性糖在5~10d启动,可溶性蛋白在15~20d启动。通过荧光定量PCR检测水淹胁迫后胁迫相关基因的表达,初步认为MhWRKY1、MhWRKY40b和MhMYB121基因可能参与了湖北海棠响应淹水胁迫的响应。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。