拟南芥高迁移率族蛋白B(HMGB)族基因的克隆及表达分析(摘要)(英文)

[目的]为研究高等植物高迁移率族蛋白B家族的功能及作用模式。[方法]运用RT-PCR方法克隆出拟南芥HMGB蛋白家族中的3个基因:At2G34450、At5G23405、At5G23420,并运用SDS-PAGE、Northern检测及亚细胞定位等手段检测这3种蛋白在大肠杆菌及拟南芥中的表达。[结果]经鉴定,以上3种蛋白的分子量分别为17.5、17.0和27.5KD,在拟南芥中表达量At5G23420At5G23405At2G34450,且这3种蛋白均定位于细胞核内。[结论]该研究结果为深入研究高等植物中HMGB家族蛋白的生物学功能奠定了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定(摘要)(英文)

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其分别转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

高迁移率族核小体结合蛋白及其应用潜能

高迁移率族核小体结合蛋白(High-mobility group nucleosome-binding proteins,HMGN)几乎存在于所有哺乳动物和多数脊椎动物的细胞核中,属于HMG蛋白家族。HMGN是现在唯一已知的特异性结合在核小体上的非组蛋白,能够改变染色质的结构、增强染色质模板的转录/复制,参与DNA复制/表达、细胞分化、器官发育及基因表达调控等细胞的生命活动。目前,HMGN包括HMGN1、HMGN2、HMGN3、HMGN4和HMGN5。研究显示,HMGN1据其所在位置的不同,有着截然不同的功能。在细胞核内,HMGN1作为一种特殊定位的生物蛋白,与核小体直接结合而调节基因的转录和影响染色质的结构;在细胞外环境,HMGN1通过toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)促进抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APCs)的活化和补充,从而促进特定抗原免疫应答。警报素(Alarmins)是一种内源性介质,当机体受到危险信号刺激时,它能快速的释放到细胞外,招募并激活APCs增强特异性免疫和非特异性免疫反应。认识HMGN及其作用对其在多方面的应用有重要意义。     

高迁移率族蛋白B1的生物学特性与应用

高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)是一类广泛分布于真核细胞中的非组蛋白核蛋白,主要作用是维持核小体结构稳定及调节基因复制、重组等.高迁移率族蛋白B1(high mobilitygroup protein box 1,HMGB1)是HMG家族成员之一,广泛存在于各型细胞的胞核和胞质中.随着     

紫花苜蓿高迁移率族蛋白基因MsHMG-Y调控花期的功能分析

【目的】开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志,对植物的生物量有重要的影响。紫花苜蓿作为世界上最重要的饲草作物之一,其产量和品质与开花时间密切相关。紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期,此时产量和品质最佳。前期获得一个与花期相关的编码基因HMG-Y,通过分析其结构及表达模式,探究其在开花调控途径中的功能,为揭示开花调节机制提供理论基础。【方法】同源克隆MsHMG-Y,并对其进行多序列比对和进化树分析。利用qRT-PCR检测不同组织和不同开花时期该基因的表达水平;分析MsHMG-Y受光照、赤霉素（GA3）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的表达模式;观察过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的表型,并分析开花促进因子与抑制因子的表达水平。【结果】MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y相似性最高,亲缘关系最近。组织特异性分析显示,MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达,其中,在父本和母本中均为花中表达量最高,叶中表达量最低;在早花表型父本的初花期表达量最高,在晚花表型母本的花芽分化期相对表达量最高。光周期分析表明,延长光照到16 h后,MsHMG-Y表达水平下调,延长光照到28 h后,MsHMG-Y表达水平持续低于对照组,说明该基因受光诱导后下调表达。外施50 μmol·L^-1 GA3、100 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 MeJA后,与对照组相比,MsHMG-Y表达水平均上调,其中,GA3诱导1 h时表达量最高,为对照的3.5倍;SA诱导6 h时表达量最高,为对照的24倍;MeJA诱导3 h时表达量最高,为对照的11倍,说明该基因受3种激素诱导。表型观察发现,与对照相比,过表达MsHMG-Y紫花苜蓿开花较晚,促进开花相关基因的表达水平均下调,抑制开花相关基因的表达水平均上调,其中,表达量变化显著的有促进开花基因MsPHYA、MsGI和MsFTa1,分别降低了4.9、3.9和2.8倍,抑制开花基因MsTEM1和MsSVP的表达量分别提高了2.5和1.9倍。【结论】MsHMG-Y受光周期及外源激素GA3、SA和MeJA的诱导表达。MsHMG-Y对延迟苜蓿开花的调控机制有重要作用。     

拟南芥Ran2基因的原核表达及产物的纯化

采用RT-PCR方法扩增Ran2cDNA完整的编码区序列,构建pTYB2-Ran2重组质粒,转化大肠杆菌ER2566,经IPTG诱导蛋白表达后SDS-PAGE分析表达产物及存在形式。结果表明,表达的蛋白26ku与预期的理论值一致,并以包涵体形式存在;包涵体经纯化、破碎变性、复性及PBS透析,得到纯度较高的表达蛋白(Ran2)。     

拟南芥AtCpNifS克隆及其原核表达

从哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)中克隆了AtCpNifS的完整CDS序列。通过测序和序列比对分析,确认了克隆序列的完整性和正确性。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体(BL21-pET28-AtCpNifS),并从该质粒中成功分离了表达蛋白(AtCpNifS)。     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥

为了研究大豆(Glycine max)Gm F-box基因的功能,以含有Gm F-box基因全长c DNA序列的p JET1.2-Gm F-box质粒为模板,通过PCR扩增获得Gm F-box基因的c DNA序列,并将该基因构建到植物表达载体p EGAD中,构建了由Ca MV35S启动子驱动Gm F-box基因的植物表达载体p EGAD-Gm Fbox,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染方法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过除草剂筛选和PCR检测转基因拟南芥,初步证明已获得转大豆Gm F-box基因的拟南芥。     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

拟南芥AFP4的克隆、原核表达和纯化及其与ABI5的互作

拟南芥ABI5相互作用蛋白AFP4(ABI five binding protein 4)是植物中的一个小分子蛋白,其表达特性与ABI5相似,受ABA诱导。以拟南芥Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cv. Columbia为材料,通过PCR扩增了AFP4基因的完整编码序列。扩增片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间和酵母双杂交载体pGBKT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。将ABI5基因的编码序列插入到酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。重组质粒测序结果表明,所克隆的AFP4和ABI5编码区序列分别与NCBI数据库收录的AFP4基因(GenBank登录号NM_111081.2)和ABI5基因(GenBank登录号NM_129185.3)完全一致。重组原核表达载体含有AFP4片段的重组融合蛋白的理论分子量为53.4 ku。将重组质粒转化至大肠埃希菌表达菌株BL21 Star (DE3)中诱导表达,并经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。将含有AFP4和ABI5的酵母双杂交重组质粒共同转化酿酒酵母AH109中进行酵母双杂交。结果表明,重组融合蛋白在大肠埃希菌E. coli BL21 Star (DE3)中表达的适宜条件为:IPTG浓度为0.4 mmol·L^-1、25 ℃下诱导表达6 h。在上述条件下,重组融合蛋白占细胞破碎后上清液总蛋白的41.6%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,AFP4融合蛋白在SDS-PAGE分析时呈现单一条带。该条带经过抗6xHis标签肽的抗体分析,呈阳性。该条带经酵母双杂交分析结果表明,AFP4和ABI5在酵母细胞中可以相互作用。