甘薯潜隐病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

甘薯是中国重要的旱地作物,具有天然的杂交优势,适应能力强且营养丰富,在中国广泛种植。在甘薯种植过程中,甘薯病毒的感染会导致甘薯产量与品质的下降,其中甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)是甘薯生产上常见的病毒之一,建立甘薯潜隐病毒的快速检测方法,对于该病的诊断及防御极其重要。根据NCBI数据库中甘薯潜隐病毒的全序列,选择保守性较强的外壳蛋白基因(cp基因),设计了一对全长引物与两对特异性引物。利用全长引物构建了甘薯潜隐病毒的阳性标准质粒,完成了特异性引物的筛选,并对其扩增条件进行了退火温度、循环数及引物浓度的优化。对该方法的灵敏度及特异性进行了检测,确定了甘薯潜隐病毒的RT-PCR检测技术体系。利用本体系对采集的15份疑似染病的甘薯样本进行检测,检测结果中有3份为甘薯潜隐病毒阳性。试验证明该检测方法具有很高的特异性与灵敏性,能够在甘薯脱毒薯苗生产中甘薯潜隐病毒的检测提供有力的技术支持。     

植物激素检测方法研究进展及在橡胶树中的应用

植物激素乙烯、茉莉酸等在橡胶树生长发育、产量和品质形成中具有重要作用。近年来,植物激素检测方法在前处理技术、检测仪器和检测数量等方面均取得重要进展。随着橡胶树研究从产量调控向品质形成转变,精确的激素检测方法的作用愈加凸显。本研究从样品前处理技术和仪器分析两方面详细综述了乙烯、烯茉莉酸等主要植物激素检测方法的研究进展,并结合橡胶树生长发育和品质形成调控机制,展望了在橡胶树生理与分子机制研究中的应用前景,为橡胶树激素精确定量、橡胶树产量和品质调控技术研究打下坚实基础。     

甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为了快速进行甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断,该研究建立了一个能够同时检测SPCSV、SPLV和SPFMV这3种病毒的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank公示的甘薯病毒基因序列来设计3种甘薯病毒的引物,分别对模板浓度、退火温度、Mg2+浓度和循环次数进行优化,同时对模板浓度进行10倍梯度稀释,检测多重RT-PCR灵敏度。结果显示,模板浓度为19 ng/μL、退火温度为52℃、Mg2+浓度为0 mmol/L、循环次数为40次时,可以同时扩增出大小为276 bp、570 bp、425 bp三种病毒的基因片段,多重RT-PCR检测灵敏度为10-4,单一RT-PCR检测灵敏度为10-3,多重RT-PCR检测灵敏度是单一RT-PCR的10倍。该研究使用优化的多重RT-PCR检测技术可获得稳定、灵敏、准确、高效地和同时地检测田间复合侵染的3种甘薯病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-time RT-PCR方法.用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒.应用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58× 102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2％;用建立的方法对实验接种IBV M41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系.研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测.     

川菜中辣椒素类物质检测方法的建立及辣味特征分析

建立一种快速、有效的超高效液相色谱-串联质谱法检测川菜样品中辣椒素类物质的分析方法,并分析了12个批次经典川菜的辣味特征。样品经乙醇提取后,采用HLB固相萃取小柱进行净化和富集,以0.1%甲酸水-甲醇作为流动相分离目标物。结果表明,在0.10～100.0 ng/mL浓度范围内,辣椒素与二氢辣椒素标准品的线性关系均良好,其检出限0.05μg/kg,定量限0.15μg/kg,加标回收率为80.5%～86.8%,相对标准偏差4.1%～6.8%。该法适用于川菜菜品中辣椒素类物质的测定及辣味特征的分析,具有样品处理简便、净化效果好、分析速度快的优点。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究

为建立一种特异、敏感的PEDV的检测方法。根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒CV777株的M基因序列,设计了一对特异性引物,扩增长度为680 bp的片段。将PCR产物进行测序,与CV777株、SH5株M基因的同源性分别为99.2%和97.6%。试验表明：该方法具有较好的特异性和敏感性,并能检测到PEDV的RNA浓度下限为100 pg/μL。从福建省的3个地区共采集58份哺乳仔猪腹泻样品,并应用此方法进行检测,其阳性检出率为87.9%。     

猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒（SVDV）高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因序列,针对IBV M基因全序列设计合成了一对引物, 以IBV疫苗株为模板, 建立了检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增, 获得与预期大小相符, 长度为1105bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA。结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查。     

耕地质量预警的研究与应用研究进展

为了进一步研究和探索耕地质量预警,从土壤质量和土地利用变化、预警理论方法和指标体系、预警模型、基于WebGIS平台的预警应用等角度分析和总结了国内外近20年耕地预警的研究进展,提出了要从土壤肥力与质量、高标准基本农田、遥感、耕地污染4个方面进行耕地质量的综合预警。     

郁金香碎色病毒RT-PCR检测方法的建立

郁金香病毒病的发生可导致郁金香切花及鳞茎品质下降,严重制约郁金香产业的发展。因此,建立快速、准确的郁金香病毒检测体系是减少病毒对郁金香的危害、恢复种性的关键问题。本研究选取对郁金香危害最严重的郁金香碎色病毒(TBV)作为研究对象,分别选取了8个感染TBV的郁金香感病植株和健康植株为材料,基于TBV核酸序列设计了21对特异引物组合,建立RT-PCR病毒检测体系,并将该检测体系用筛选出的特异性引物在8个材料中进行了验证。结果表明,共有10对引物组合可从带有TBV的感病植株中扩增出目的条带,序列结果与GenBank中登录的TBV序列同源性达90%以上,该检测体系稳定、可靠,特异性引物组合有广泛的适用性。     

贵州主要蔗区高粱花叶病毒(SrMV)的PCR检测

为了弄清贵州主要蔗区甘蔗花叶病害发生情况,本研究通过PCR检测方法,对采自贵州主要蔗区的52份疑似花叶病样品进行检测,结果表明:39份样品呈阳性(检出率为75%)。对阳性样品的PCR扩增产物测序比对,PCR扩增产物的基因序列与Gen Bank中SrMV分离物的基因序列同源性在96%~99%,由此证实贵州主要蔗区甘蔗普遍感染SrMV。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。     

山东葫芦科蔬菜上病毒病种类检测及黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定

为了检测和鉴定山东地区葫芦科蔬菜上病毒病种类,从山东诸地11个蔬菜种植区采集了867个葫芦科蔬菜疑似感病样品。利用黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒、甜瓜黄斑病毒、瓜类褪绿黄化病毒、李属坏死环斑病毒及甜瓜坏死斑点病毒等特异性引物对疑似感病样品分别进行RT-PCR检测,各病毒检出率分别为34.8%,10.4%,20.0%,41.7%,27.0%,7.8%,2.6%,1.7%,0,0.9%。表明除PNRSV外,其他9种病毒在山东各地均有发生,且CMV和TMV发病率较高,2种或2种以上病毒复合侵染也很普遍。同时为明确山东地区CMV分离物的株系分化状况,选取11个地区有代表性的CMV阳性样品,测定其外壳蛋白(Coat protein,CP)和RNA3核苷酸序列并进行序列比对和进化分析,结果显示侵染山东地区葫芦科蔬菜的CMV分离物均属于IB亚组,与韩国分离物As(AF013291)相似性最高,未发现其他株系。     

侵染南瓜的西瓜花叶病毒和黄瓜花叶病毒CP基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR的方法,用马铃薯Y病毒属病毒3′-末端序列的简并引物和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）外壳蛋白（CP）基因的特异引物,对采自山东聊城的一表现花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜样品进行了检测,同时扩增到了西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）和CMV 2种病毒的基因组片段,说明该样品受到WMV和CMV 2种病毒的复合侵染。这2个病毒分离物分别被命名为WMV-liaocheng和CMV-liaocheng。序列测定及分析结果表明,它们与其它相应病毒分离物CP基因核苷酸序列的同源性分别为91.2-98.0%和77.0-97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.4-98.5%和81.2-99.1%。根据完整CP 基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：18个WMV分离物可分为3组,其中WMV-liaocheng 与HLJ、CHN及Habenaria等分离物表现出较近的亲缘关系,形成Ⅲ组;30个CMV分为两个亚组,其中CMV-liaocheng属于亚组I,CMV-liaocheng可能发生过重组。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的检测技术及脱毒方法研究进展

为了弄清目前建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)病毒检测和脱毒的研究概况,本研究详细阐述了2种病毒的检测方法、采用的脱毒技术和脱毒效率,分析比较了不同技术存在的弊端,指出现有的脱毒方法已不能满足兰科植物脱毒研究的需要。在此基础上,进一步提出应采用安全、可靠的新型脱毒技术来解决目前兰科植物产业瓶颈问题。超低温脱毒技术是近年来发展迅速的脱毒技术,具有独特优势,目前已在多种植物上成功应用,该方法的应用有望解决2种病毒脱毒方面存在的问题。     

Resistance of early-maturing European maize germplasm to sugarcane mosaic virus (SCMV) and maize dwarf mosaic virus (MDMV)

Sugarcane mosaic virus (SCMV) and maize dwarf mosaic virus (MDMV) are the most important viruses of maize in Europe. In field and greenhouse experiments, 122 early-maturing European maize inbreds (45 flint and 77 dent lines) were evaluated for their reaction to artificial inoculation by SCMV and MDMV. Three dent inbreds (D21, D32, FAP1360 A) with complete resistance and four dent inbreds (D06, D09, R2306, FAP1396A) with partial resistance against both potyviruses under both greenhouse and field conditions were identified. All other inbreds were highly susceptible to both SCMV and MDMV. Selection for virus resistance in maize breeding could be performed with only one virus at a time because all inbreds resistant to SCMV were also resistant to MDMV. Rank correlations between percentages of infected plants in greenhouse and field trials ranged from 0.51 to 0.72 for both SCMV and MDMV, suggesting that prescreening of breeding materials for virus resistance can be performed in the greenhouse but final evaluation in multilocation trials in the field is recommended.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.     

Inheritance and linkage analysis of resistance to zucchini yellow mosaic virus, watermelon mosaic virus, papaya ringspot virus and powdery mildew in melon

A melon (Cucumis melo L.) breeding line derived from PI 414723 is resistant to three potyviruses,watermelon mosaic virus (WMV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), papaya ringspot virus (PRSV), and to powdery mildew (PM). The inheritance and linkage relationships of these four resistances were studied in a segregating F2 population and derived F3 families from a cross between cultivar Top Mark and the resistant breeding line. Dominant monogenic inheritance of all four resistances was observed. We report that line 414723-4S3, which was initially selected as a source of ZYMV and WMV resistance, is also a source of dominant monogenic resistances to PRSV and PM race 1. We also report on genetic linkage (significant departure from independent segregation, χ² = 58.1, p≪ 0.0001) between resistance to WMV and ZYMV. The map distance between these loci was estimated to be 7.5 cm. The genes for resistance to PM and PRSV segregated independently from each other, and from ZYMV and WMV resistance. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

Inheritance of resistance to the Moroccan watermelon mosaic virus in the cucumber line TMG-1 and cosegregation with zucchini yellow mosaic virus resistance

Inbred lines derived from the Chinese cucumber (Cucumis sativus L.) cultivar, ‘Taichung Mou Gua’ (TMG), have been shown to be resistant to several potyviruses including: zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), zucchini yellow fleck virus (ZYFV), watermelon mosaic virus (WMV) and the watermelon strain of papaya ringspot virus (PRSV-W). Recently, an additional virus that infects cucurbits, the Moroccan watermelon mosaic virus (MWMV), has been determined to be a distinct member of the potyvirus group. This study demonstrates that TMG-1 possesses resistance to MWMV. Rub or aphid inoculated TMG-1 seedlings remain free of symptoms. Progeny analyses of the F₁, F₂ and backcross generations show that resistance to MWMV is conferred by a single recessive gene (proposed designation, mwm). Sequential inoculation of progeny possessing resistance to ZYMV followed by MWMV (or MWMV followed by ZYMV) and analysis of F₃ families derived from F₂ individuals selected for resistance to ZYMV indicate that both resistances are conferred by the same gene, or two tightly linked genes. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

Resistance of Cucurbita moschata to watermelon mosaic virus type 2 and its genetic relation to resistance to zucchini yellow mosaic virus

Summary Cucurbita moschata Menina originating from Portugal is known to carry a single dominant gene, Zym, for zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) resistance. Resistance to watermelon mosaic virus type 2 (WMV2) was found in the same cultivar. In resistant plants, WMV2 migration from inoculated leaves or cotyledons seems to be limited and blocked. Resistance to WMV2 is conferred by one dominant gene and is effective against eight strains from different geographic origins. Results of linkage studies, based on co-inoculation of plants with WMV2 and ZYMV, indicate that resistance to these two viruses is conferred by the same gene, probably Zym, or perhaps by two closely linked genes.