鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。     

地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的研究与应用

【目的】建立鼻气管鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale,ORT)快速、准确的检测方法。【方法】利用PCR扩增鼻气管鸟杆菌16 S rRNA基因的671 bp特异性片段,经回收纯化后用地高辛标记,建立了地高辛标记探针诊断ORT的方法。【结果】特异性试验表明,地高辛标记探针可与ORT不同血清型参考菌株的核酸发生特异性杂交,而与鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的核酸杂交均为阴性;敏感性试验结果表明,地高辛标记探针对ORT的最低检出量为100 pg/μL;利用该探针对分离菌株和疑似病料进行检测,结果均与PCR检测结果一致。【结论】建立了地高辛标记探针检测ORT的方法,为ORT的诊断提供了一种敏感性高、特异性强、简便且易行的方法。     

用DNA—RNA杂交检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫鸡ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点交和碱性磷酸酶为色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法。     

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。     

基于RAA-CRISPR/Cas12a的鸡毒支原体核酸检测方法的建立

将重组酶介导的扩增技术（RAA）、CRISPR/Cas12a的切割反应及酶标仪或试纸条相结合,建立设备依赖度低的鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）核酸检测方法。以MG基因mgc2为靶标,设计CRISPR RNA及RAA引物,并优化检测体系、评价新建核酸检测方法性能。结果表明,该方法特异性和灵敏性均较好,对除MG外其他常见病原体检测结果均为阴性,检测下限可达10 copies·μL-1。与商业化荧光定量PCR试剂盒对比检测45份临床样品符合率超过93%。综上,通过将RAA与CRISPR/Cas12a相结合,建立一种不依赖昂贵仪器的MG核酸检测方法,具有良好应用前景。     

FPV 4b核心蛋白基因的克隆及其探针制备

利用PCR方法成功克隆了FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段。序列分析表明:该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列同源性为99.5%,只有7个碱基差异(第215位C→A,第386位T→A,第388位G→A,第1 014位T→G,第1 034位T→G,第1 137位C→T,第1 143位A→G)。回收FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒pMD18-T-4b,用EcoRⅠ酶切pMD18-T-4b后得到1个约360 bp大小的DNA片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100 mg/L。敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10 pg。特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

异羟基洋地黄毒甙元核酸探针对马立克氏病毒DNA的检测

应用异羟基泣地黄毒甙元标记的ＤＮＡ探针，检测了细胞培养物和鸡羽髓中提取的马立克氏病毒核酸。结果发现，异羟基洋地黄毒甙元标记的马立克氏病毒血清Ⅰ型（ＧＡ株）核酸的ＢａｍＨＩ－Ｌ片段探针，只与马立克氏病毒Ⅰ型核酸发生杂交，而不与Ⅱ型（ＳＢ－１）或Ⅲ型（ＨＶＴ）发生杂交。对３６份鸡羽髓病料提取的病毒核酸的杂交检测与琼扩试验相比较，前阳性率为９４．４％。后仅为８６．１％。由此说明，Ⅰ型病毒的核酸探针可     

RT-PCR和核酸探针在IBV检测中的应用

用ＰＣＲ和核酸探针杂交检测了３种毒株（Ｈ１２０株,Ｍ４１株,ＨＫ株）在鸡胚中的繁殖动态及人工感染鸡和自然感鸡气管粘液及肾组织内的ＩＢＶ．结果表明：在鸡胚中繁殖３种毒株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）,ＰＣＲ最早检出时间为２０～２４ｈ,克隆探针最早检出时间为２４～３０ｈ;用克隆核酸探针检测人工感染鸡,１２ｈ后能从肾脏中检出病毒。对７只就诊鸡的病变肾脏进行杂交检测和ＰＣＲ扩增,有５只均呈阳性反应。ＩＢＶ分离株ＨＫ株与标准株Ｍ４１株经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和ＨｉｎｄⅢ酶切及ＲＦＬＰ分析,表明其属同一马萨诸塞血清型。ＰＣＲ和核酸杂交技术为生产上提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测ＩＢＶ病毒及诊断ＩＢＶ的新方法,对ＩＢＶ的血清定型也有一定的实用价值。     

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌USDA110总DNA作为探针，与快生型大豆根瘤菌杂交，没有杂交斑点形成．而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点，表明该探针具有种和部分菌株特异性．用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交，检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力，发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70％～90％．     

地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测.