家蚕bcl-2基因的克隆、序列分析及其表达模式

为了研究家蚕耐氟中毒分子机理,本文采用荧光差异显示技术分析了家蚕对氟化物耐性品系441和感性品系440添氟后的基因表达的差异,获得差异表达cDNA片段A14-6,数据库分析为编码抗凋亡基因bcl-2 (AB008449)。BmBCL-2编码965个氨基酸,分子量为108.800 kD,等电点为6.370。结构分析无C末端疏水跨膜结构,含有19个外显子和18个内含子,剪切信号符合GT/AG规则。蛋白质同源性分析表明BmBCL-2与BCL-2家族蛋白一样均有BH1、BH2、BH3和BH4功能域,用ClustalX1.83、MEGA3.1等软件分析氨基酸序列和得到系统进化树,结果表明BmBCL-2与其它物种BCL-2蛋白保守性较低。RT-PCR结果表明,bcl-2在家蚕耐氟品系441和感性品系440五龄第48h五个组织均有表达,在441DZ（耐氟品系）中表达丰度明显高于440DZ（敏感品系）,并且在脂肪体表达量相对较高。200mg•L-1氟化钠和清水对照处理家蚕后48h,bcl-2在41DZ和440DZ中肠的转录水平没有显著变化,但在添氟后,耐氟品系441F表达水平相对高于440F品系。以上结果暗示该基因可能与家蚕的耐氟性有关。     

西伯利亚蓼Tau类谷胱甘肽转移酶基因的克隆与表达分析

用RACE技术从西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）中克隆了谷胱甘肽转移酶（PsGSTU1）基因完整编码区 cDNA序列,长度669 bp,编码222个氨基酸。经与谷胱甘肽转移酶家族其它成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定PsGSTU1属于谷胱甘肽转移酶Tau家族。利用荧光定量RT-PCR分析表明,PsGSTU1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,茎中表达量最高,叶和地下茎次之; 3% NaHCO3胁迫后,此基因在叶和茎中的最大表达量出现在胁迫后48 h,而茎在72 h;去胁迫后,此基因在不同部位的表达量表现为：地下茎＞叶＞茎。将PsGSTU1完整的cDNA片段连接至pET28a质粒以构建原核表达载体,并导入大肠杆菌（Escherichia coli）,经IPTG诱导后表达了分子量为26 kD的目的蛋白,表达PsGSTU1的大肠杆菌显著提高了耐受NaHCO3胁迫的能力。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB（GenBank登录号：AADK01019318）,并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性（Hd=0.962）、平均核苷酸差异数（K=7.495）、核苷酸多样性（Pi=0.03287）、密码子有效值（ENC=41.623〈61）、偏爱指标（CBI=0.496〉0）和χ2检验计算（χ2=0.713）显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.     

家蚕消化液35K蛋白酶基因的克隆及序列同源性分析

根据纯化的家蚕35K蛋白酶N末端氨基酸序列设计简并引物，从家蚕中肠组织cDNA库中分离并克隆该蛋白酶基因,对由DNA推测的氨基酸序列进行同源性检索。结果表明：存在于家蚕消化液中的35K蛋白酶基因长939bp，可编码313残基的多肽链，其中信息肽为22aa，活性肽为22aa，成熟的蛋白酶由269aa组成。与其他昆虫消化液的类胰凝乳蛋白酶具有同源性，是存在于家蚕消化液中的一种新发现的蛋白酶。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

黄瓜生长素受体同源基因的克隆、序列特征及表达模式分析

为了解生长素受体及其信号通路在黄瓜(Cucumis sativus L.)中的调控机制和生物学功能,寻找提高产量的新途径并指导农业生产,我们以拟南芥(Aabidopsis)生长素受体家族AtTIR1/AFBs基因序列为参照进行比对,从黄瓜全基因组数据库中筛选出2条具有很高同源性的基因序列,分别命名为Cs TIR和CsAFB.克隆和测定了这2个基因的cDNA序列,构建了过表达载体,拟在黄瓜中开展反向遗传学研究.基因序列提交至GenBank并得到收录,其中CsTIR的登录号KC414935.1,CsAFB登录号KC414934.1.采用生物信息学方法对CsTIR和CsAFB蛋白的基本理化性质、功能结构域进行初步预测,对其在物种间的保守性进行进化分析,推测它们可能是黄瓜的生长素受体.采用semi-q RT-PCR分析了这两个基因的时空表达模式,发现10d黄瓜幼苗中CsAFB基因的表达量在根和叶中比在茎中高,CsTIR基因在茎中几乎检测不到表达;70d成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB表达,无明显组织特异性.本研究为寻找黄瓜生长素受体提供了实验依据,为进一步研究生长素信号通路在黄瓜中的功能及调控机理提供了基础资料.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

家蚕核型多角体病毒的PCR检测及其部分序列分析

为研究应用PCR技术进行家蚕核型多角体病毒广东株的敏感性检验以及探讨不同地理株系的基因水平的相互关系,本文通过对家蚕核型多角体病毒BmNPV广东株的人工繁殖与纯化,引用了一对根据多角体蛋白基因设计的引物phy35／phy36,对BmNPV的基因组模板DNA进行了PCR扩增,并对其产物进行测序分析。结果显示,PCR技术均可扩增检测出3×10^8个／mL至3×10^2个／mL不同浓度的BmNPV模板DNA,特异目标片段大小约为680bp,且扩增带的亮度随着病毒液浓度的降低而减弱,说明应用引物phy35／Dhy36进行PCR方法可以有效地应用于检测BmNPV病毒感染的家蚕。同时,测序获得了BmNPV广东株多角体蛋白pof佩edrin基因674bp大小的片段,GC含量为46．4％。经过BLAST比对分析,与BmNPV泰国株的相似性为99％,暗示家蚕BmNPV广东株与泰国株的BmNPV（登录号AY779044）亲缘关系非常相近,两者可能属于BmNPV的不同地理株系。通过系统发育树的进一步分析发现,家蚕核型多角体病毒广东株polyhedrin基因部分序列与家蚕NPV分离株s9多角体蛋白基因（DQ231336）关系很近。     

壬基酚对家蚕（Bombyx mori）生长发育的影响

采用添加环境激素壬基酚（Nonylphenol,NP）人工饲料饲养家蚕（Bombyx mori）的验方法,观察了家蚕的生长速度、生长量、变态、生命力情况。结果表明,连续取食0．500mmol·L^-1以上浓度壬基酚的饲料,家蚕幼虫和蛹的生长速度、生长量、发育整齐度、生命力等都明显下降,在发育后期和蜕皮、化蛹、羽化等变态时期更加明显。同时,NP在蚕体内可能有累积作用。2．000mmol·L^-1浓度的NP能使家蚕幼虫很快死亡。NP对家蚕生长发育的影响有明显的性别差异,导致家蚕的雌雄大小开差缩小,并且具有显著的浓度效应和时间效应,是环境激素效应的典型表现。     

39K基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制和转录的影响

39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白.迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV) 39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚.本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系BmN细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度.进一步利用qPCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P＜0.01).为了进一步了解39K基因对BmNPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用.综上所述,可知39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强.本研究结果将为深入了解BmNPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料.     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

红色荧光标记载体pBacA4DsRed的构建及其在蚕卵中的瞬时表达

红色荧光蛋白(RFP)是从海葵(Discosoma)中分离的一种新荧光蛋白基因,可以在紫外线激发下发出红色荧光,最大发射波长为583nm,在细胞中荧光转换效率高,是目前发现