松材线虫rDNA的测序和PCR-SSCP分析

 本文为克服形态鉴定的不足,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体DNA(r DNA)的内部转录间隔区(ITS1)区(约308bp)的测序结果显示:松材线虫种内区别很小,不超过1bp;拟松材线虫种内区别较大,最大达7bp;这2种线虫的种间区别为32~39bp。根据以上测序结果,本文结合单条线虫DNA的提取技术,对14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性(PCR-SSCP)分析,结果表明PCR-SSCP分析技术可明确区分这2种线虫,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。     

湖南病死马尾松中分离线虫的鉴定

分离自对湖南郴州、耒阳、张家界地区的病死马尾松样品,采用形态鉴别和分子生物学鉴别相结合的方法对其进行鉴定.形态鉴定结果显示分离检出线虫更符合拟松材线虫特征.同时采用ITS-PCR-RELP方法对病死马尾松中分离线虫进行分子鉴定,ITS区经EcolI和HindⅢ酶切后得到110、160、242、404bp 4条特征带,与拟松材线虫相同,而与松材线虫有明显区别.而且ITS及CoI基因序列信息显示,湖南病死马尾松中分离线虫与松材线虫的同源性分别为92.9%、89.3%,而与拟松材线虫的同源性高达97.2%、95.2%.研究结果表明湖南病死马尾松中分离的线虫为拟松材线虫.     

马尾松萎蔫病树一种线虫分离物的鉴定

 2002年从贵阳市南明区采集到濒临死亡的马尾松标样,用改进的浅盘分离法对其进行了病原物的分离、纯化、形态学及分子生物学鉴定。结果表明,萎蔫死亡松树分离出的线虫形态特征与Mamiya报道的拟松材线虫形态特征相符。用伞滑刃线虫ITS区(internal transcribed spacer)通用引物VRF1(5'CGTAACAAGGTAGCTGTAG 3')和VRF2(5'TC-CTCCGCTAAATGATATG 3')对其基因组DNA进行PCR扩增,并对其PCR产物进行回收、克隆和测序。测序结果显示,此ITS序列与南京松材线虫的同源性为77.6%,与基因库已报道拟松材线虫序列U93554的同源性为93.5%,而与云南拟松材线虫江川种群、峨山种群和西畴种群的同源性为97.9%。通过以上形态学和分子生物学的研究,将贵阳市南明区采集到的马尾松萎蔫病树线虫分离物鉴定为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)。     

一种雌虫具尾尖突松材线虫的鉴定

为明确从辽宁省枯死红松病木中分离到的一种雌虫具明显尾尖突线虫群体的分类地位,采用改良漏斗法分离样品中的线虫并进行形态学鉴定,通过灰葡萄孢Botrytis cinerea人工培养观察雌虫尾尖突的形态变化,并基于rDNA 28S和ITS基因序列分析对其进行分子生物学鉴定。结果显示,经形态学鉴定初步判定该线虫群体为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus,具有典型的雄虫交合刺和雌虫阴门盖,但雌虫尾末端宽圆且无尾尖突的个体极少,只有2%～3%,其余雌虫个体尾末端有长约1.8μm(0.2～3.2μm)的尾尖突。但经人工培养产生的后代雌虫尾端均钝圆,无尾尖突。结合形态学和分子生物学鉴定结果,最终确定该线虫群体为松材线虫R型株系。松材线虫雌虫具有明显尾尖突的现象虽较为罕见,但仍会影响松材线虫的准确鉴定,需引起林业部门和口岸植物检疫部门的高度关注。     

伞滑刃线虫属部分种群28S RNA基因中D2-D3区的特征

 对伞滑刃线虫属部分种群包括松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、莱奴尔夫伞滑刃线虫和泰国伞滑刃线虫等种的28S RNA基因中D2-D3区进行了系统的研究。经PCR扩增发现, 不同的种均产生1个约750 bp的片段。利用限制性内切酶对其进行PCR-RFLP分析, 除松材线虫与拟松材线虫的酶切图谱比较接近外, 其它伞滑刃线虫种群获得不同的酶切图谱。图谱分析发现, 限制性内切酶Bsh1236I能区分2个近似种——松材线虫和拟松材线虫。进一步分析表明:Bsh1236I对28S RNA基因D2-D3区的酶切可用于鉴定本研究中伞滑刃线虫属的不同种群。同时运用clustalx1.8和Mega 2软件对28S RNA基因D2-D3区构建部分伞滑刃线虫属种群的系统树, 显示出与形态学基本一致的聚类组群。     

松材线虫PCR快速检测方法研究

松材线虫是许多国家的检疫性有害生物 ,其形态与拟松材线虫非常相似。为克服传统的形态学鉴定的不足 ,本研究依据松材线虫rDNA基因部分序列 ,通过单个碱基的故意错配 ,设计了一对特异性引物 ,运用PCR方法 ,最终实现了对单条松材线虫的快速检测。该检测方法具有很好的实用性和稳定性     

云南松树伞滑刃线虫种类鉴定

 2000~2001年从云南省34个县/市调查采集到病松树样本161份,鉴定出伞滑刃属线虫3个种即拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、霍夫曼伞滑刃线虫(B. hofmanni)和赫列尼库斯伞滑刃线虫(B. hellenicus)。后2种为我国新记录种,其寄主分别是华山松(Pinus armandii)和云南松(P. yunnanensis),为该2种线虫的世界新寄主记录。目前云南省没有发现松材线虫,但在16个县/市发现拟松材线虫。     

利用RAPD研究松材线虫和拟松材线虫亲缘关系

 用RAPD技术对18个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系基因组DNA多态性进行研究。在事先优化的条件下,用15个随机引物进行PCR扩增,一共扩增出165条谱带,多态性为91.5%。通过聚类分析,结果表明:松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的差异性,但种间差异大于种内差异,因而松材线虫和拟松材线虫应为2个独立的种。     

伞滑刃属线虫专家鉴定系统

近年来,口岸检验检疫机构多次在进境木质包装中截获活体线虫,其中多次截获到伞滑刃属的松材线虫和与其形态相似的拟松材线虫.由于线虫形体细小,种的形态差别不大,一般非专业的工作人员难以进行鉴定.     

梗天牛属的3种重要林业害虫

辐射松幽天牛、褐梗天牛和Arhopalus ferus （Mulsant）是梗天牛属的3种重要害虫,对火灾后的死亡和衰弱木造成严重为害。其中褐梗天牛在我国已有分布,能够携带拟松材线虫。本文查阅了国内外相关资料,介绍这3种害虫的分类鉴定特征和生物学特性。     

繁殖松材线虫最佳真菌筛选试验

 据全国第一届线虫病害研讨会报道,目前国内外培养繁殖松材线虫线虫Bursaphelenchus xylophilus常用的真菌是灰葡萄孢Botrytis cinerea。作者在1988年至1991年开展对松材线虫致病性、松材线虫对药剂毒性反应的研究过程中,急需繁殖大量松材线虫供试验使用,因此开始了本试验。     

拟松材线虫尾部形态多样性研究

本文对14个拟松材线虫群体和2个松材线虫群体进行了研究,研究表明拟松材线虫群体尾尖突平均长度为3.28～5.82μm,尾形有6种,主要为亚洲型和欧洲型两种。拟松材线虫和松材线虫的交合伞复杂多样,共有12种类型,两者的交合伞没有明显差别,都由2种或2种以上形态构成。交合伞的多样性和不确定性表明,以此作为一个主要分类特征是不恰当的。     

树栖真菌对扩散型松材线虫生活史的影响

 松材线虫病是一种涉及多个生物因子的复杂病害系统,其病原松材线虫的生活史受媒介昆虫、寄主、树栖真菌和伴生细菌等多种因素影响。利用感染松材线虫病的马尾松林内的两种优势内栖真菌的3个菌株,松球壳孢(Sphaeropsis sapinea)E11、MHS7.3和小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)M32,接种于松褐天牛模拟蛹室,研究松褐天牛蛹期和羽化过程松材线虫种群动态,以及松褐天牛携带扩散型松材线虫的动态变化。结果表明,天牛发育处于蛹期时,松材线虫主要以扩散型三龄幼虫(J_Ⅲ)附着于天牛体表;发育至羽化期时,松材线虫主要以扩散型四龄幼虫(J_Ⅳ)位于天牛体内。不同优势内栖真菌接种处理下,松褐天牛携带的扩散型幼虫数量的大小顺序为:小孢拟盘多毛孢M32>松球壳孢E11>松球壳孢MHS7.3,这与模拟蛹室中松材线虫种群的大小顺序是一致的,表明松褐天牛携带的线虫数目与蛹室中线虫种群的大小关系密切。在松褐天牛携带的J_Ⅲ、J_Ⅳ和扩散型幼虫(J_Ⅲ＋J_Ⅳ)占线虫种群比例方面,松球壳孢E11和MHS7.3均大于小孢拟盘多毛孢M32,显示不适宜繁殖的真菌能促进群体内更多个体转化为扩散型虫态。J_Ⅳ在蛹期的第二天即从天牛体内分离得到,但数量极少,随着J_Ⅲ在羽化前达到最大值,J_Ⅳ也开始大量出现,预示着较大J_Ⅲ种群数量可能是J_Ⅳ大量发生的基础条件之一。研究结果表明在松材线虫的扩散过程中,松林优势树栖真菌对媒介天牛携带的松材线虫数量产生显著影响。     

松材线虫口岸检疫方法

通过2001～2007年在南京机场、新生圩等3口岸现场采集的695批次木材料样本进行检疫,4次发现了松材线虫;总结了切合口岸实际的松材线虫检疫方法;针对口岸上截获松材线虫时常出现仅有幼虫的问题,研究了用真菌进行单异活体培养和松材线虫罹病木保湿法培养松材线虫的两种快速培养方法;9种真菌选择培养松材线虫效果表明,灰葡萄孢是培养松材线虫的最有效真菌,盘多毛孢等用作培养松材线虫也有一定效果.     

松材线虫组DNA条形码筛选

本文基于Gen Bank中登录的14种松材线虫组线虫的28S、18S和ITS部分基因DNA序列,利用遗传距离法及分子生物学方法评价其各自作为松材线虫组DNA条形码序列的适用性。结果显示,28S(拟松材线虫不分亚种)、28S(拟松材线虫分亚种)、18S和ITS的基因序列种内成对遗传距离平均值分别为0.0071、0.0030、0.0007、0.0043,种间成对遗传距离平均值分别为0.0476、0.0454、0.0052、0.1556,其中28S、18S基因序列种内及种间距离存在一定程度的重叠,ITS具有一定程度的Barcoding gap。3个基因序列构建的NJ进化树显示,28S、ITS构建的系统进化树具有较高的节点支持率,可以有效将14个松材线虫组线虫分离成独立分支,而且28S可以有效鉴别出拟松材线虫的2个亚种;基于18S基因构建的进化树不能对吉拉尼伞滑刃线虫、日本冷杉伞滑刃线虫、拟松材线虫进行有效区分。因此,28S、ITS区具有一定的遗传距离间隔以及相对较高的物种识别率,可以作为松材线虫组线虫候选条形码基因。     

进境美国火炬松中松材线虫滞育型4龄幼虫的鉴定

宁波口岸在对一批来自美国的火炬松原木线虫检疫时,发现少量口针退化的幼虫,疑似松材线虫滞育型4龄幼虫,但未发现繁殖型幼虫或成虫。由于这种现象极为少见,实验室进一步对这些幼虫进行观察测计和人工培养,并挑取单条线虫作核糖体28S基因扩增测序和序列分析。结果表明,该种线虫为松材线虫。由于松材线虫滞育型4龄幼虫头部口针退化,且尾部有尾尖突,不但难以判断为松材线虫,甚至容易被误判为腐生线虫,从而导致检测差错。因此,本文对松材线虫滞育型4龄幼虫形态进行描述,可供其他实验室检测鉴定时参考。     

天津局从船舶垫舱木料中截获松材线虫

天津局从船舶垫舱木料中截获松材线虫１９９５年１２月２５日，天津动植物检疫局在对“海桥”轮上来自日本的垫舱木料实施检疫时，截获了大量活体线虫。经初步鉴定为松材线虫Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ和拟松材线虫Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕ...     

木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测

松材线虫是进境木质包装中的重要检疫对象之一。本研究以进境木质包装中截获的12种伞滑刃属线虫,包括4种不同来源的松材线虫、3种不同来源的拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫、伯氏伞滑刃线虫及拟小刺伞滑刃线虫为材料,进行实时荧光PCR检测。结果显示,仅松材线虫可观察到明显的荧光强度变化,而其他线虫的荧光强度没有变化。通过研磨样品的方法,提取单条松材线虫的DNA,进行实时荧光PCR试验,检测成功率为100%,且不论是雄虫、雌虫或幼虫均能检测出来。该研究对于我国口岸进境木质包装中松材线虫的检测具有一定的实际意义。     

Bxy-egl-30调控松材线虫早期个体发育的生物学功能研究

“发育快，交配效率高”是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。通过生物信息学分析、原位杂交和RNAi等技术，本研究明确了Bxy-egl-30在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)个体生长发育过程中的功能。生物信息学分析结果表明Bxy-egl-30编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸，属于EGL-30蛋白亚基家族。原位杂交结果显示Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段的表达具有特异性，在胚胎期与幼虫期该基因广泛表达于性腺、肠道和附近的体壁细胞等部位；在成虫期，该基因在雌虫的阴户肌肉和雄虫的性腺部位集中表达。RT-qPCR结果显示Bxy-egl-30在二龄期表达量最高，胚胎期次之，三龄期、四龄期和成虫期表达量依次降低。浸泡Bxy-egl-30双链RNA后，松材线虫胚胎的孵化率下降了10.88%,二龄期、三龄期幼虫活力明显下降，每分钟头摆频率约下降4次。致病性接种实验结果显示松材线虫被Bxy-egl-30双链RNA干扰后致病性减弱，减缓了黑松的死亡时间，干扰组黑松的死亡时间比对照组晚9 d。本研究明确了Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段...     

食线虫真菌蠕虫埃斯特菌对植物寄生线虫的侵染特性

为评价食线虫真菌蠕虫埃斯特菌Esteya vermicola菌株NKF 13222的生防应用价值,采用2%水琼脂培养基平板接种法测定了该菌株对7种植物寄生线虫的诱引、黏附和侵染能力,并比较了其对不同线虫的侵染特性.结果显示,该菌株的菌丝对松材线虫、拟松材线虫、腐烂茎线虫和水稻干尖线虫均有诱引作用,而对南方根结线虫、禾谷孢囊线虫和穿刺短体线虫无诱引作用;菌株的粘性分生孢子对有诱引现象的4种线虫都能黏附,接种24 h后的黏附率达到82%～99%,对无诱引现象的3种线虫不能黏附;粘性分生孢子黏附虫体后对不同线虫的侵染力存在差异,接种7 d后的松材线虫死亡率可达98%,而拟松材线虫、腐烂茎线虫和水稻干尖线虫死亡率分别为43%、35%和9%.表明蠕虫埃斯特菌不仅是松材线虫的强内寄生真菌,而且对其它重要植物寄生线虫也具有一定的应用潜力.