牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

副结核分枝杆菌ISMav2基因的克隆与序列分析

以副结核分枝杆菌C-2染色体DNA为模板,以ISMav2基因特异性引物进行PCR扩增,获得约340 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出重组质粒pMDTM18-T-ISMav2,为进一步研究ISMav2基因及其在副结核病诊断中的应用奠定了基础.     

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析

以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体.经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65.序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K～10株的同源性为99.2%.     

腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

以腐蹄病A型节瘤拟杆菌染色体DNA为模板,根据设计的上、下游引物进行PCR反应,扩增出了大小约0.78kb的基因片段,用T4DNA连接酶将PCR产物与pGEM-T-Easy载体连接,构建了重组质粒。并以EcoRV和SalI双酶切重组质粒鉴定目的基因的插入方向。经序列测定,克隆的目的基因片段为Pili基因。     

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础.利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA 73,构建pLA 73-UreB载体,将pLA 73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性.液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1 710 bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Western blot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性.成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础.     

共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究

建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA73,构建pLA73-UreB载体,将pLA73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,柚捉质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测UreB的表达及活性,液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1710bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表迭并具有良好的免疫原性。成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础。     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆与序列分析

用CTAB法从枯草杆菌（Natto)提取基因组DNA，聚合酶链式反应（PCR）扩增获得约1.3kp的DNA片段，在T4DNA连接酶作用下，将扩增片段连接到pUCm-T载体上，载化Ecoli DH5a感受态细菌。将初步鉴定的阳性细菌提取质粒DNA进行PCR鉴定和测序，序列分析结果证明获得了包含全部读码框的纳豆激酶基因。     

牛分枝杆菌MPB64基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌ValleeⅢ染色体DNA为模板,以MPB64成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了642 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定证实,成功地构建了pGEM-T-64克隆载体。序列分析结果表明:该基因序列与Mycobacterium bovis BCG Tokyo的MPB64成熟蛋白基因序列同源性为100%。     

结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子的克隆和测序

根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热休克蛋白70启动子的基因序列设计1对引物,PCR扩增出150 bp的片段后连接到pMD18-T载体上,用重组质粒载体转化大肠杆菌DH5α,PCR鉴定转化菌后进行序列测定。结果表明,该序列与已报道的3株结核分枝杆菌和1株牛型分枝杆菌的相应序列完全同源。该序列可用于构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒载体,启动外源基因在卡介苗菌中的表达。该基因的克隆可为下一步研究开发人和动物以卡介苗为载体的多价活疫苗打下基础。     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子的克隆和测序

根据结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）热休克蛋白70启动子的基因序列设计1对引物，PCR扩增出150bp的片段后连接到pMD18-T载体上．用重组质粒载体转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定转化菌后进行序列测定。结果表明．该序列与己报道的3株结核分枝杆菌和1株牛型分枝杆菌的相应序列完全同源。该序列可用于构建大肠杆菌-分枝杆菌牟梭质粒载体．启动外源基因在卡介苗菌中的表达。该基因的克隆可为下一步研究开发人和动物以卡介苗为载体的多价活疫苗打下基础。     

新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从新城疫病毒洛阳分离株中扩增出HN基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建pcDNA3-HN重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析的方法对重组DNA进行鉴定,成功构建了新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体。     

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

犬冠状病毒部分纤突蛋白基因的分子克隆

以RT－PCR方法扩增出犬冠状病毒（CCV）YS1、CI1 2株国内分离病毒的部分纤突蛋白基因，经酶切鉴定为CCV特异性核苷酸片段。采用平端连接法将Wizard^TM PCR纯化试剂盒纯化的PCR产物克隆于pUC19 Sma I酶切位点上，获得YS1pUC19、CI1pUC19重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定表明：重组质粒大于蓝斑菌质粒。以BamHI、Kpn I双酶切重组质粒可获得比原PCR产物略大的核苷酸片段，并从中以PCR方法扩增出与原PCR产物大小相同的核苷酸片段。     

转TGEV-S基因玉米中目的基因的PCR检测及优化

为提高转基因玉米中目的基因的检出效率,以猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白（TGEV-S）转基因玉米为材料,利用PCR方法检测样品中的目的基因.通过对PCR反应体系中4种不同DNA聚合酶和8种退火温度进行比较,建立和优化了转基因玉米中TGEV-S基因的PCR检测方法.对450株转基因玉米叶片DNA和种子DNA中的TGEV-S基因片段进行检测,并设计33对引物检测插入转基因玉米基因组DNA中的质粒pBAC9020DNA片段.结果显示,LA Taq酶对叶片DNA和种子DNA中TGEV-S片段的PCR扩增敏感性和特异性均优于其他Taq聚合酶,且退火温度为53～55℃时扩增效果较好.分别对450份转基因玉米叶片DNA和种子DNA检测结果显示阳性率分别为82.5％和76.3％.利用33对引物进行的PCR扩增及测序结果显示质粒pBAC9020基因片段已全部插入该玉米基因组DNA中.本试验建立的转TGEV-S基因玉米PCR检测方法敏感性和特异性高,为转基因玉米阳性植株的检测奠定了坚实的基础.     

小尾寒羊催乳素基因5'侧翼调控区的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出小尾寒羊催乳素基因5'侧翼调控区的161 bp大小的片段,经SSCP检测到2种基因型(AA、AB),将这2种基因型片段分别克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列.催乳素基因扩增片段第63处发生了单碱基的改变(C→A).小尾寒羊催乳素基因2种基因型核苷酸序列与母牛的同源性为92.5%.     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.